于軍超，張樂萃，高志強(qiáng)，張鶴曉，馬貴平，蒲 靜，張利峰，吳亞瓊，王慧珊，朱淑芬，張 偉，谷 強(qiáng)

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東 青島266109；2.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局，北京 朝陽100026；3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東 泰安271018）

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的偶蹄動物的一種急性高度傳染性疫病，是國際貿(mào)易中最重要動物傳染病之一［1］。最易感染的動物是黃牛、牦牛、犏牛、水牛、豬、羊、駱駝、鹿。通過交叉保護(hù)試驗(yàn)和血清學(xué)試驗(yàn)確定FMDV有7個血清型，即O、A、C、Asia1和SAT1、SAT2、SAT3，及70個以上的血清亞型［2］。血清型之間無交叉和交叉免疫現(xiàn)象［3］。通過檢測特異性抗體應(yīng)答反應(yīng)，可對FMDV感染作出診斷。通常采用病毒中和試驗(yàn)（VN）和ELISA方法，也是貿(mào)易中指定使用的方法。中和試驗(yàn)具型特異性，但是要求條件高，并且需要2～3d才能提供結(jié)果，少數(shù)血清在稀釋倍數(shù)低時會出現(xiàn)假陽性。ELISA試驗(yàn)也具型特異性，而且具備敏感、快速、穩(wěn)定、可定量等優(yōu)點(diǎn)［3］。本試驗(yàn)旨在利用原核高效表達(dá)系統(tǒng)在大腸桿菌中表達(dá)FMDV O型的VP1蛋白，建立檢測FMDV O型抗體的間接ELISA方法。

1 材料與方法

1.1 試劑 Trizol，購自Invitrogen公司；DNA片段回收試劑盒，限制性內(nèi)切酶SacⅠ，HindⅢ，pMD－T20載體克隆試劑盒，T4DNA連接酶，DNA快速純化回收試劑盒，質(zhì)?？焖偬崛〖兓噭┖?，購自TaKaRa公司；M－MLV反轉(zhuǎn)錄酶，RNA酶抑制劑，TaqDNA聚合酶，購自Promega公司；His·Bind蛋白純化試劑盒，購自Novagen公司；HRP標(biāo)記的rec Protein G，購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 病毒核酸、質(zhì)粒、宿主菌及血清 O型O／YN－1／2005病毒核酸，云南檢驗(yàn)檢疫局動物檢疫實(shí)驗(yàn)室提供；原核表達(dá)質(zhì)粒pET－32a，本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌（E.coli）Top10，Rosetta，購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；口蹄疫病毒陽性血清，購自蘭州獸醫(yī)研究所。

1.3 口蹄疫病毒O型VP1基因擴(kuò)增、克隆 根據(jù)已知序列于口蹄疫病毒O型基因兩側(cè)序列，利用Oligo 6.0設(shè)計(jì)以下兩對引物，用于擴(kuò)增O型和基因的編碼區(qū)序列，設(shè)計(jì)的引物名稱、序列見表1。

表1 用于擴(kuò)增口蹄疫病毒1D編碼區(qū)的引物名稱和序列

42℃反轉(zhuǎn)錄30min之后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將擴(kuò)增產(chǎn)物用DNA片段回收試劑盒回收后，按照試劑盒說明將目的片段克隆于pMD－T20載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10，涂布于含有氨芐的LB瓊脂培養(yǎng)基中，于37℃條件下過夜培養(yǎng)。第2天挑取菌落于LB中37℃過夜培養(yǎng)，對菌液進(jìn)行PCR鑒定后進(jìn)行測序。將序列正確的質(zhì)粒，命名為pMD－T20－O－VP1。

1.4 原核表達(dá)載體構(gòu)建與序列分析 分別用限制性內(nèi)切酶SacⅠ，HindⅢ對 pMD－T20－O－VP1和pET－32a37℃過夜雙酶切，然后用T4連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定和酶切鑒定。將鑒定為陽性的質(zhì)粒分別命名為pET－32a－O－VP1。對插入片段進(jìn)行序列測定。

1.5 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將重組質(zhì)粒pET－32a－O－VP1轉(zhuǎn)化Rosetta宿主菌后，加入終濃度為1.0 mmol／L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，分別在誘導(dǎo)前，誘導(dǎo)后6h取菌液1.0mL，5 000r／min離心10min，收集菌體。將表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS－PAGE電泳。

1.6 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)的優(yōu)化 在菌液OD600nm分別為0.6和1.0時用1.0mmol／L的IPTG在37℃進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，分析其表達(dá)量的變化；之后，在菌液OD600nm＝1.0時，分別用0.5mmol／L，1.0 mmol／L和2.0mmol／L 的IPTG 在37℃誘導(dǎo)表達(dá)，分析其表達(dá)量的變化；此外，在菌液OD600nm＝1.0時，用1.0mmol／L IPTG 分別于28℃和37℃條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，分析其表達(dá)量的變化。

1.7 重組蛋白的純化與復(fù)性 在變性條件下采用His·Bind試劑盒對重組蛋白VP1進(jìn)行親和層析純化。在4℃條件下進(jìn)行稀釋復(fù)性。復(fù)性24h后，裝入透析袋中，對50mmol／L Tris－Cl（pH 值9.0）進(jìn)行透析，將透析后的蛋白溶液用PEG（分子量20 000）濃縮后，12 000r／min（4℃）離心15min，收集上清，過濾除菌后，小份分裝，保存于－80℃。

1.8 重組蛋白的反應(yīng)原性檢測

1.8.1 Western－blot分析 將誘導(dǎo)表達(dá)菌和對照菌全菌體蛋白經(jīng)SDS－PAGE電泳分離后，按常規(guī)方法進(jìn)行電轉(zhuǎn)印。轉(zhuǎn)印結(jié)束后，用口蹄疫病毒O型陽性血清和HRP標(biāo)記的rec蛋白G進(jìn)行Westernblot檢測，驗(yàn)證蛋白的反應(yīng)原性。

1.8.2 ELISA分析 用0.5mol／L的碳酸緩沖包被液將0.25mg／mL的純化重組蛋白抗原分別作50，100，200，400，800倍5個倍比稀釋度，包被酶標(biāo)反應(yīng)板，陽性血清和陰性血清作1∶40稀釋，酶標(biāo)抗體采用HRP標(biāo)記的rec蛋白G，用ELISA方法驗(yàn)證蛋白的反應(yīng)原性。

1.9 重組間接ELISA方法的建立 按照ELISA方法建立的常規(guī)程序，對方法建立過程中的各個條件進(jìn)行了優(yōu)化和確定其中酶標(biāo)抗體采用HRP標(biāo)記的rec蛋白G。

1.10 間接ELISA方法特異性試驗(yàn)

1.10.1 阻斷試驗(yàn) 用血清稀釋液將FMDV O型滅活抗原做1∶2稀釋，同時用血清稀釋液把O型陽性血清和陰性血清分別做各稀釋度倍比稀釋，觀察FMDV O型病毒抗原是否能阻斷陽性血清反應(yīng)。1.10.2 特異性交叉反應(yīng)試驗(yàn) 以最適濃度抗原包被酶標(biāo)板，分別對FMDV－A型、O型、C型、Asia 1型陽性血清，收集的豬瘟、豬藍(lán)耳病、豬偽狂犬病、豬細(xì)小病毒的陽性血清作1∶40稀釋，作ELISA測定，從而驗(yàn)證方法的特異性。

1.11 板內(nèi)和板間重復(fù)性試驗(yàn) 用重組蛋白包被ELISA板，對3份陽性血清和3份陰性血清樣品進(jìn)行檢測，重復(fù)4孔，進(jìn)行板內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)；用重組蛋白分別包被4塊反應(yīng)板，分別對2份陽性血清和2份陰性血清進(jìn)行板間重復(fù)性試驗(yàn)，并對檢測結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

1.12 標(biāo)準(zhǔn)陽性血清效價測定 O型標(biāo)準(zhǔn)陽性血清從1∶40作2倍系列稀釋，確定方法的檢測限。

1.13 對臨床樣品的檢測 用建立的間接ELISA方法檢測了2000年以來血清樣品355份，其中包括進(jìn)口血清257份，免疫血清98份。并與液相阻斷ELISA試劑盒進(jìn)行這些臨床樣品進(jìn)行檢測，比較符合率。

2 結(jié)果

2.1 O型口蹄疫病毒VP1編碼基因擴(kuò)增結(jié)果 在比對口蹄疫病毒O型1D基因編碼區(qū)兩側(cè)序列基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)引物，對 O／YN－1／2005病毒核酸進(jìn)行 RTPCR擴(kuò)增，經(jīng)電泳，觀察到了預(yù)期大小為657bp的特異性條帶（見圖1）。

圖1 目的片段RT－PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 O型口蹄疫病毒VP1原核表達(dá)載體的構(gòu)建與序列測定分析 將657bp的PCR產(chǎn)物克隆入pMD－T20載體后，經(jīng)限制性內(nèi)切酶SacⅠ，HindⅢ對pMD－T20－O－VP1和pET－32a37℃過夜雙酶切后，將VP1克隆入pET－32a，即為構(gòu)建的表達(dá)載體pET－32a－O－VP1。將表達(dá)載體質(zhì)粒進(jìn)行測序，與預(yù)期結(jié)果一致。

2.3 O型口蹄疫病毒VP1蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將重組質(zhì)粒pET－32a－O－VP1轉(zhuǎn)化 Rosetta宿主菌后，將誘導(dǎo)表達(dá)前以及誘導(dǎo)后不同時間，分別取菌液1.0 mL，5 000r／min離心10min，收集菌體，加入2×SDS上樣緩沖液，煮沸5min，用12%SDS－PAGE膠檢查，結(jié)果見圖2，在誘導(dǎo)后6h，可觀察到明顯的重組蛋白表達(dá)，分子量約為43ku，與預(yù)期大小一致。

2.4 重組蛋白的表達(dá)條件優(yōu)化 經(jīng)試驗(yàn)確定的最佳表達(dá)條件為在菌液OD600nm＝1.0時，用0.5 mmol／LIPTG在28℃誘導(dǎo)8h，可產(chǎn)生部分可溶性表達(dá)，但大部分菌體蛋白為包涵體表達(dá)。

2.5 重組蛋白的純化與復(fù)性 經(jīng)純化透析后得到高純度的重組蛋白，見圖3。

2.6 重組蛋白的反應(yīng)原性檢測

2.6.1 Western－blot檢測結(jié)果 進(jìn)行 Westernblot檢測，可以檢測到約43ku大小的預(yù)期條帶，結(jié)果見圖4。表明重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性。

2.6.2 ELISA試驗(yàn)結(jié)果 ELISA試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同量的表達(dá)蛋白包被酶標(biāo)反應(yīng)板之后，用1∶40陰陽性血清檢測，P／N值可達(dá)5.24～7.71之間，進(jìn)一步表明重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性，可作為重組抗原建立ELISA方法。

2.7 重組ELISA方法的建立

慢跑能增加大學(xué)生的積極幸福感，對心理煩惱和疲勞感無影響；慢跑結(jié)合音樂可以增加大學(xué)生的積極幸福感，能有效地降低大學(xué)生的心理煩惱感，對疲勞感無響應(yīng)。兩種類型的慢跑，即慢跑組和慢跑結(jié)合音樂組的對比：在積極幸福感上，運(yùn)動后慢跑組和慢跑結(jié)合音樂組無差異；在心理煩惱感上，慢跑結(jié)合音樂比慢跑更有效地降低大學(xué)生心理煩惱感；在疲勞感上，慢跑比慢跑結(jié)合音樂更能降低大學(xué)生的疲勞感。

2.7.1 重組蛋白抗原最適包被濃度和待檢血清稀釋濃度的確定 隨著抗原濃度的減小和血清稀釋倍數(shù)的增加，血清的OD450不斷減小，當(dāng)重組抗原包被濃度為0.062 5μg時，血清稀釋度為1∶40時，P／N值較高，而且陰性血清OD450值相對較低。據(jù)此，我們確定抗原包被量為0.062 5μg，血清稀釋度為1∶40。

2.7.2 重組蛋白抗原包被和封閉條件的確定 用重組蛋白在最適包被濃度包被酶標(biāo)板，37℃中2h，然后于4℃條件下過夜，所測得的P／N值較2、3組高，因此選為最適包被條件。

2.7.3 封閉液的確定 3種適用于此酶標(biāo)抗體的封閉液，比較封閉效果。含1%明膠的PBST封閉液的封閉效果好，從而確定為合適的封閉液。

2.7.4 酶標(biāo)抗體反應(yīng)時間確定 為適用于多種動物的抗體檢測，我們選擇HRP標(biāo)記的rec G作為酶標(biāo)抗體，經(jīng)優(yōu)化，確定 HRP標(biāo)記的rec G（1∶2 000稀釋）的反應(yīng)時間為37℃30min。

2.7.5 間接ELISA方法陰陽臨界值的確定 根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，樣本的OD450值＞陰性血清OD平均值X＋3×SD，可以在99.9%的置信水平上判定為陽性。計(jì)算30份血清的OD450值平均值＝0.191，標(biāo)準(zhǔn)差SD＝0.039，因此，ELISA陰陽性臨界值等于0.191＋3×0.039＝0.308。為便于判定結(jié)果，確定樣本臨界值為0.3。

2.8 特異性試驗(yàn)

2.8.2 特異性交叉反應(yīng)試驗(yàn) 結(jié)果表明，僅O型陽性血清與包被抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)，結(jié)果為陽性，其他血清型的FMDV陽性血清和陰性對照血清的OD450nm值均小于0.3，為陰性。表明，重組蛋白與口蹄疫病毒O型陽性血清，有較好的特異性，可以用于口蹄疫病毒O型抗體的檢測。

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 對于不同的血清樣品，板內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)變異系數(shù)最大為4.7%，小于5%。對4份已知的陰陽性血清用4塊板子進(jìn)行板間重復(fù)試驗(yàn)的變異系數(shù)最大為9.49%，小于10%，可以滿足檢測需求，表明建立的方法重復(fù)性良好。

2.10 標(biāo)準(zhǔn)陽性血清檢測極限測定 O型標(biāo)準(zhǔn)陽性血清從1∶40作2倍系列稀釋，確定方法的檢測靈敏度。結(jié)果顯示，血清效價為1∶320。

2.11 對臨床樣品的檢測 用建立的間接ELISA方法檢測了2000年以來血清樣品355份。與口蹄疫病毒O型液相阻斷ELISA試劑盒進(jìn)行比較，比較符合率，結(jié)果見表2。

表2 對臨床樣品檢測結(jié)果的比較

經(jīng)過計(jì)算，本試驗(yàn)建立的間接ELISA方法與液相阻斷ELISA比較，特異性為98.46%，敏感性為100%，兩者的符合率為98.87%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析，兩種方法的差異不顯著（P＞0.05）。

3 結(jié)論與討論

在本試驗(yàn)中，我們應(yīng)用生物信息學(xué)對口蹄疫病毒O型VP1的抗原指數(shù)進(jìn)行分析，并進(jìn)行重組表達(dá)，用來作為檢測抗原，用以檢測口蹄疫病毒O型抗體。

盡管克隆的VP1基因經(jīng)序列測定無突變，但仍含有一些稀有密碼子［4］，但我們采取可給予表達(dá)過程提供稀有密碼子的Rosetta受體菌，外源基因以包涵體的形式獲得高效表達(dá)。但也有一部分以可溶性存在。我們將包涵體溶解后，在變性條件下采用His·Bind蛋白純化試劑盒純化蛋白。獲得高純度蛋白。通過Western－blot以及ELISA試驗(yàn)證明表達(dá)產(chǎn)物具有良好的抗原性。而且與其他的陽性血清無交叉反應(yīng)。

ELISA方法具有特異、敏感、重復(fù)性好以及易于操作等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛用于多種動物傳染病的檢測。本試驗(yàn)利用原核表達(dá)的重組蛋白建立了檢測口蹄疫病毒O型抗體的間接ELISA方法，并與商品化試劑盒進(jìn)行了比較。通過對355份血清的檢測結(jié)果表明，二者在特異性為98.46%，敏感性為100%，符合率為98.87%，進(jìn)一步收集更多數(shù)量的血清對我們的方法進(jìn)行驗(yàn)證和完善，將是我們今后的重要任務(wù)。

［1］Office International des Epizooties.Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals［M］.Office International des Epizooties，Paris，F(xiàn)rance.www.oie.int.2012.

［2］殷震，劉景華.動物病毒學(xué)［M］.2版.北京：科學(xué)技術(shù)出版社，1997.

［3］Lu Z，Cao Y，Bao H，etal.Techniques developed in China for foot－and－mouth disease［J］.TransboundEmerg Dis，2008，55（5／6）：196－199.

［4］Sanyal A.Monhapatra J K，Kumar R M，etal.Complete nucleotide sequence analysis of a vaccine strain and a field isolate of foot－and－mouth disease virus serotype Asia I with an insertion in VP1genomic region［J］.Acta Viol，2004，48（3）：159－166.