葛寶偉，張 志，李曉成，于學(xué)武，段亞良，高 豐

（1.吉林大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130062；2.遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 沈陽(yáng)110164；3.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東 青島266032）

豬瘟也稱為古典型豬瘟（classical swine fever，CSF），是由豬瘟病毒（CSFV）引起的豬的高度接觸性傳染病。豬瘟病毒屬于黃病毒科（Flaviviridae）、瘟病毒屬（Pestivirus），基因組為單股正鏈RNA，大小約為12.3kb，包括5′－端非翻譯區(qū)（5′UTR）、一個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF）和3′－端非翻譯區(qū)（3′UTR）［1］。CSFV惟一的開(kāi)放閱讀框可翻譯成分子量約438kDa的多聚蛋白，并進(jìn)一步在宿主細(xì)胞和病毒蛋白酶作用下裂解為4種結(jié)構(gòu)蛋白（C，E0，E1，E2）及8種非結(jié)構(gòu)蛋白（Npro，p7，NS2，NS3，NS4A，NS4B，NS5A 和NS5B）［2］。目前認(rèn)為豬瘟病毒只有一個(gè)血清型，但豬瘟病毒不同毒株毒力差異很大，可引起急性豬瘟、亞急性、慢性豬瘟和妊娠母豬繁殖障礙［3］。因此，在核酸序列比較基礎(chǔ)上的豬瘟病毒基因分型對(duì)于追蹤流行毒株來(lái)源和傳播、闡述病毒遺傳變異特征和流行規(guī)律具有重要意義。此外，CSFV的E2糖蛋白存在于感染細(xì)胞或病毒粒子表面，相對(duì)于其他結(jié)構(gòu)蛋白保守性最低，最易發(fā)生變異。E2糖蛋白參與了CSFV對(duì)細(xì)胞的感染過(guò)程并與CSFV的毒力有關(guān)，攜帶有能刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫的抗原決定簇，是CSFV最主要的保護(hù)性抗原蛋白。國(guó)內(nèi)外學(xué)者認(rèn)為E2基因變異有可能是導(dǎo)致該病毒逃脫或抵御免疫保護(hù)的主要原因［4－6］。鑒于此，本試驗(yàn)利用 RT－PCR的方法對(duì)2006年～2011年遼寧省不同地區(qū)發(fā)病豬群中CSFV的感染情況進(jìn)行了檢測(cè)，并對(duì)所測(cè)定的20株CSFV E2基因與國(guó)內(nèi)外參考毒株的相應(yīng)序列進(jìn)行同源性分析及氨基酸序列比對(duì)。研究結(jié)果，為了解遼寧省不同地區(qū)CSFV流行毒株的遺傳變異規(guī)律以及制定更為科學(xué)合理的防控措施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源及處理 2006年～2011年間，從遼寧省不同地區(qū)采集發(fā)病豬群的病死及撲殺或流產(chǎn)胎兒組織臟器樣品，主要為扁桃體、淋巴結(jié)、腎臟、肺臟；待檢活豬，用注射器抽取頸靜脈血3～5mL。

取待檢組織與生理鹽水按1∶5（質(zhì)量濃度）比例，于研缽中充分研磨制成組織勻漿液，8 000r／min（4℃）離心2min，取上清液置于1.5mL滅菌離心管中備用；全血樣品待血凝后取血清，置1.5mL滅菌離心管中備用。制備的樣品在2℃～8℃保存不應(yīng)超過(guò)24h，長(zhǎng)期保存應(yīng)分裝后置－70℃以下，避免反復(fù)凍融。

1.2 主要試劑 禽源反轉(zhuǎn)錄酶（AMV）、dNTP Mix－ture、Ribonuclease Inhibitor、rTaqDNA聚合酶、DNA Marker DL－2 000、Agarose Gel DNA Purification kit、pMD18－T載體，均為大連TaKaRa公司產(chǎn)品；Trizol為Invitrogen公司產(chǎn)品；TIAN prep Mini Plasmid Kit，均購(gòu)自北京天根生物有限公司產(chǎn)品。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 對(duì)GenBank中公布豬瘟病毒基因組序列進(jìn)行比較分析后，利用軟件Primer 5.0針對(duì)豬瘟兔化弱毒株（AY805221）E2基因A區(qū)保守段設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，序列如下：

Forward Primer：5′－TTG AGC TCC TGT TCG ACG－3′（18bp）

Reverse Primer：5′－CTG CGG TGG TCA CAC AAT C－3′（19bp）

預(yù)期擴(kuò)增DNA片段長(zhǎng)度為276bp，并含有1個(gè)型特有的HinfⅠ酶切位點(diǎn)。上述引物由北京博尚生物工程公司合成，上游用滅菌雙蒸水稀釋，下游用RNAfree水稀釋，引物濃度為20pmol／μL，分裝保存于－20℃冰箱備用。

1.4 總RNA的提取及cDNA的合成 采用Invitrogen公司Trizol試劑一步法提取總RNA，取已處理備用的樣品200μL于1.5mL滅菌EP管中，加入600 μL Trizol LS Reagent試劑，上下顛倒混勻，4℃靜置5 min；加入200μL氯仿，充分震蕩至乳化均勻，4℃靜置15min后，12 000r／min（4℃）離心15min；輕輕吸取上清約450μL轉(zhuǎn)移入另一1.5mL滅菌EP管，加入500μL預(yù)冷的異丙醇，輕輕顛倒混勻，置－20℃過(guò)夜；12 000r／min（4℃）離心10min；棄去上清液，加入1mL預(yù)冷的75%乙醇，12 000r／min（4℃）離心10 min；棄去上清液，室溫干燥后，溶于25μL DEPC水中；同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系及條件按反轉(zhuǎn)錄酶說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，20μL反轉(zhuǎn)錄體系中含RNA模板1μg，5×AMV Buffer 4μL，dNTP Mixture（各10mmol／L）2μL，Ribonuclease Inhibitor（40U／μL）0.5μL，Reverse Primer 2μL，AMV（5U／μL）2μL，用 DEPC水補(bǔ)至20μL。輕輕混勻，室溫放置10min后移入42℃恒溫槽中水浴1h，然后冰浴2min，所得反應(yīng)液用于PCR，或－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 E2基因PCR擴(kuò)增 以cDNA為模板，建立25μL的PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)體系為：10×PCR Buffer 5μL，dNTP Mixture（2.5mmol／L）4μL，rTaq（5U／μL）0.125μL，上下游引物（20pmol／μL）各0.125μL，cDNA 10μL，用滅菌ddH2O補(bǔ)至25μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，94℃30s，58℃30s，72℃45s共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，最后72℃充分延伸10min。

1.6 PCR擴(kuò)增片段的回收與克隆 利用凝膠回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增陽(yáng)性產(chǎn)物，經(jīng)純化后連接入pMD－18T載體，轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)菌，挑選陽(yáng)性克隆菌落，接種2mL LB培養(yǎng)基，37℃搖震培養(yǎng)過(guò)夜，然后提取經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性克隆菌株的質(zhì)粒。1.7 序列測(cè)定與分析 將陽(yáng)性克隆質(zhì)粒送交寶生物工程（大連）有限公司進(jìn)行測(cè)序，對(duì)測(cè)定的序列首先應(yīng)用DNAStar軟件中Edit進(jìn)行了編輯，然后用采MegAlign軟件中Clustal W算法進(jìn)行比較和分析，同時(shí)結(jié)合MEGA3.1軟件進(jìn)行NJ進(jìn)化分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增結(jié)果 利用RT－PCR方法檢測(cè)在2006年～2011年遼寧省發(fā)病豬群中豬瘟病毒感染情況，共鑒定出20株豬瘟病毒分別命名為L(zhǎng)N169－09、LN221－10、LN236－10、LN261－10、LN274－10、LN284－11、LN288－11、LN291－11、LN299－11、LN28－07、LN100－08、LN129－08、LN133－09、LN155－09、LN164－09、LN6－06、LN15－06、LN239－10、LN209－10、LN312－11（均為血毒），擴(kuò)增獲得大小為276bp豬瘟病毒的E2基因片段（見(jiàn)圖1）。

圖1 病料中CSFV的檢測(cè)結(jié)果

2.2 遺傳演化分析 在序列測(cè)定的20株豬瘟病毒中，基因1型的毒株有2株分別為L(zhǎng)N239－10和LN209－10，其余毒株均為基因2型。一方面，屬于基因1型的毒株（LN239－10、LN209－10）全部為基因1.1亞型。另外，通過(guò)進(jìn)化樹(shù)看出，Shimen株和豬瘟兔化疫苗株HCLV都屬于基因1.1亞型，而被進(jìn)一步分型為疫苗株的1.1a亞型和野毒Shimen株的1.1b亞型。通過(guò)進(jìn)化樹(shù)可以看出，LN239－10和LN209－10分離毒株均屬于1.1a亞型，有可能為疫苗株。另一方面，屬于基因2型18株野毒株又分別屬于基因2.1亞型（17株）和2.2亞型（1株為L(zhǎng)N169－09）并且屬于基因2.1亞型毒株的比例高達(dá)94.4%，這說(shuō)明基因2.1亞型的豬瘟野毒株已經(jīng)成為遼寧省豬瘟野毒的主要流行毒株（見(jiàn)圖2）。

2.3 遼寧省豬瘟流行病毒變異分析 從上述分析可以看出，遼寧省20份野毒株分別屬于基因2.1、2.2亞型和1.1亞型，通過(guò)軟件分析發(fā)現(xiàn)，在這20株野毒株中，屬于基因2型的18株野毒株與我國(guó)疫苗株HCLV的同源性在76.8%～80.5%之間，與我國(guó)經(jīng)典強(qiáng)毒Shimen株的同源性在77.4%～81.1%之間，而屬于基因1型的2株豬瘟毒株與疫苗株HCLV和Shimen株的同源性分別為97.4%和93.2%（見(jiàn)表1）。

此外，不同的基因亞群在E2基因高變區(qū)的氨基酸組成上有各自的特點(diǎn)，其中某些位置的氨基酸對(duì)毒株分類起著重要作用［6－7］，如第720（K）、725（D）、729（N）、738（V）位的氨基酸是基因1.1亞型的特異性氨基酸，而，第720（R）、725（G）、729（D）、738（I）的氨基酸對(duì)于基因2.1亞型的流行毒株也起到重要作用。而利用軟件分析表明，遼寧豬瘟流行毒株的變異位點(diǎn)主要分布在所測(cè)序列的前30個(gè)氨基酸。在流行毒株與弱毒疫苗之間有15個(gè)氨基酸的變異（15／63），與經(jīng)典強(qiáng)毒石門株有14個(gè)氨基酸的變異（14／63），與強(qiáng)毒Shimen株、疫苗株相比其變異率高達(dá)20%以上（見(jiàn)表2和圖3）。

3 討論

豬瘟病毒參考序列來(lái)自NCBI網(wǎng)站，選擇的參考序列包括國(guó)際豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室提供的豬瘟基因1.1、1.2、1.3、3.2、3.3、3.4、2.1、2.2、2.3 型 等各型參考毒株。另外還選擇了國(guó)內(nèi)部分省市發(fā)表的豬瘟E2序列作為參考毒株進(jìn)行比較。根據(jù)時(shí)間與地區(qū)分布，本試驗(yàn)選擇性獲得了20株豬瘟病毒大小為276bp的E2基因序列，在分析這些豬瘟病毒E2基因序列的基礎(chǔ)上構(gòu)建了近6年遼寧地區(qū)豬瘟流行毒株的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)一步分析了遼寧豬瘟病毒的分子流行現(xiàn)狀和趨勢(shì)，分析結(jié)果表明，基因2.1亞型的豬瘟野毒已經(jīng)成為遼寧豬瘟病毒的優(yōu)勢(shì)流行毒株。

?

根據(jù)常規(guī)流行病學(xué)和血清學(xué)的監(jiān)測(cè)，迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)CSF有不同的血清型［3］。但事實(shí)上，CSFV有了顯著的變異，用單克隆抗體及核苷酸序列分為不同的群或型［7－10］。而本試驗(yàn)通過(guò)以基因測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)的系統(tǒng)樹(shù)分析試驗(yàn)，明確了遼寧豬瘟流行毒株與國(guó)內(nèi)外毒株的遺傳相關(guān)性，2006年～2011年遼寧省流行毒株的優(yōu)勢(shì)基因型與傳統(tǒng)的石門系強(qiáng)毒、兔化弱毒存在核苷酸序列上存在較大差異，已由基因1型轉(zhuǎn)為基因2型，向遠(yuǎn)離疫苗毒的方向變化，豬瘟的流行毒株與疫苗株之間的同源性在76.8%～80.5%之間，與經(jīng)典強(qiáng)毒Shimen株的同源性在77.4%～81.1%之間，這一變化趨勢(shì)與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)一致［11－12］。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，遼寧豬瘟流行毒株的變異主要分布在所測(cè)序列的前30個(gè)氨基酸，在流行毒株與弱毒疫苗毒株之間有15個(gè)氨基酸的變異（15／63），與經(jīng)典強(qiáng)毒石門株有14個(gè)氨基酸的變異（14／63），變異率高達(dá)20%以上，表明近年來(lái)，遼寧流行毒株的優(yōu)勢(shì)基因型與傳統(tǒng)的石門系強(qiáng)毒、兔化弱毒在抗原性上存在較大差異，從而使遼寧地區(qū)豬瘟流行毒株可能逃脫兔化弱毒株的免疫保護(hù)，導(dǎo)致不完全免疫。分析產(chǎn)生上述變化的可能原因是，豬瘟疫苗的長(zhǎng)期、普遍使用、溫和毒力毒株的出現(xiàn)以及持續(xù)性感染的存在等因素，使得豬瘟病毒在感染動(dòng)物體內(nèi)停留的時(shí)間更長(zhǎng)，病毒面臨的壓力對(duì)病毒變異造成的影響作用更加明顯。因此，長(zhǎng)期開(kāi)展豬瘟流行毒株分子流行病學(xué)的調(diào)查研究，密切關(guān)注流行毒株的分布，尤其應(yīng)該對(duì)毒力發(fā)生改變或是對(duì)可能出現(xiàn)的疫苗逃逸株進(jìn)行研究，特別是對(duì)類疫苗源毒株的來(lái)源有待于進(jìn)一步研究是十分必要的。這不但對(duì)豬瘟病毒的病原生態(tài)學(xué)研究具有重要意義，對(duì)在世界范圍內(nèi)豬瘟的防控也具有重要影響。

表2 豬瘟病毒基因亞群毒株E2基因主要變異區(qū)氨基酸的變異情況

圖3 遼寧省豬瘟流行毒株與疫苗株HCLV和Shimen株之間的氨基酸變異圖

隨著全球經(jīng)濟(jì)貿(mào)易一體化的不斷提高，尋求動(dòng)物飼養(yǎng)利益最大化的利益驅(qū)使，以及鑒于目前豬瘟的流行形式，全球養(yǎng)豬業(yè)均面臨著有效控制豬瘟的嚴(yán)峻形勢(shì)，開(kāi)展豬瘟病毒的分子流行病學(xué)研究，建立病毒不同分離株之間的聯(lián)系，追蹤毒株來(lái)源，對(duì)流行毒株毒力、流行毒株抗原性與疫苗株抗原性差異等不可控制因素的研究，對(duì)豬瘟進(jìn)行全球監(jiān)控，發(fā)現(xiàn)防制策略中的薄弱環(huán)節(jié)，實(shí)現(xiàn)豬瘟病毒遺傳信息的全球共享，建立一體化的豬瘟防控體系將具有極其重要的意義。

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