郭新風(fēng)，王麗瓊，李煥榮，阮文科，崔德鳳，王 寧，劉鳳華

［北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京市獸醫(yī)學(xué)（中醫(yī)藥）重點實驗室，CAU－BUA TCVM教學(xué)與科研團隊，北京 昌平102206］

宿主細胞的 Toll樣受體（Toll－like receptors，TLR）通過識別病原微生物保守的分子相關(guān)模式，誘導(dǎo)天然免疫信號而激活炎性細胞因子，上調(diào)共刺激因子而激活細胞免疫，發(fā)揮抗病毒反應(yīng)［1］。TLR3能誘導(dǎo)干擾素Ⅰ型的釋放；TLR4可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)；TLR15在病毒感染中有報道，可能在機體先天性免疫中發(fā)揮作用［2－3］。

雞傳染性腔上囊病毒（IBDV）主要侵害腔上囊內(nèi)具有IgM的B淋巴細胞，引起嚴(yán)重而長期的免疫抑制，導(dǎo)致免疫失敗，影響多種病毒疫苗的免疫應(yīng)答［4］。IBDV感染可啟動機體先天性免疫，通過巨噬細胞釋放各種細胞因子抵抗病毒感染［5］；通過增強T淋巴細胞功能啟動獲得性免疫［6］。腔上囊單核細胞（BBMC）和外周血單核細胞（PBMC）作為機體重要的免疫細胞，其表面的模式識別受體在IBDV入侵中的識別作用及啟動免疫反應(yīng)的機理少有報道。本試驗使用相對熒光定量PCR技術(shù)，通過分析IBDV感染對SPF雞BBMC和PBMC在感染后不同階段TLR3／4／15mRNA表達的影響，探討IBDV感染對固有免疫反應(yīng)的影響，為進一步研究IBDV發(fā)生過程中宿主與病原相互間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料

4周齡SPF雞，購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司；雞傳染性腔上囊病毒（IBDV）BC6／86毒株，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；Trizol，購自In－vitrogen（美國）公司；淋巴細胞分離液，購自TBD公司。

2 方法

2.1 動物分組及攻毒 4周齡SPF雞30只，對照組和攻毒組各15只，再隨機分為3組，每組5只。點眼途徑感染IBDV BC6／85株標(biāo)準(zhǔn)強毒，50倍的囊最小感染量（BID）／只雞，對照組給予相同劑量的生理鹽水。

2.2 腔上囊和外周血單核細胞的制備 分別在感染后1、5、15d采集雞心臟EDTA抗凝血，按照雞淋巴細胞分離液說明書介紹的步驟進行雞外周血單個核細胞（PBMC）分離，臺盼藍計數(shù)，配成1×106個／mL濃度的懸浮液，－80℃貯存?zhèn)溆?；無菌取腔上囊，去除表面的脂肪組織、被膜等，2%犢牛血清的1640沖洗，刀背刮取腔上囊內(nèi)淋巴細胞于2%1640培養(yǎng)基中，分別進行150目篩和300目篩過濾離心，同PBMC步驟分離雞腔上囊單個核細胞，臺盼藍計數(shù)，配成1×106個／mL濃度的懸浮液，－80℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 引物的合成與RNA的反轉(zhuǎn)錄 根據(jù)Gen－Bank上各基因的序列，用Primer 5.0在保守區(qū)設(shè)計各自的特異PCR引物（表1）。引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

表1 β－actin、TLR3、TLR4與TLR15擴增引物的序列和反應(yīng)條件

按照Trizol說明書提取細胞總RNA。反轉(zhuǎn)錄在20μL體系中進行，1μL總RNA，DEPC水11 μL，Oligo（dT）0.5μL，70℃5min，M－MLV RT 5×Buffer 4μL，dNTP 2μL，MgCl21μL ，Ribo－nucelase Inhibitor 0.5μL，42℃ 60min，70℃15 min。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置－80℃冰箱備用。

2.4 SYBR GreenⅠ相對熒光定量RT－PCR檢測方法的建立 本試驗選用β－actin作為參照基因［7］。將β－actin、TLR3、TLR4和 TLR15的陽性cDNA進行10系列稀釋成6個梯度作為模板，利用各自的特異性引物進行real－time PCR建立各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線。20μL PCR反應(yīng)體系：10μL SYBR Green Real－time PCR Mix，1μL Rox Buffer，0.6μL上游引物，0.6μL下游引物，模板1μL，加水至20μL 。PCR反應(yīng)程序為：95℃5min；95℃30s，59℃30s，72℃30s，共40個循環(huán)。根據(jù)熒光值的變化，系統(tǒng)自動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。擴增效率基本一致時方可采用相對熒光定量比較CT值［8］。

2.5 統(tǒng)計分析 應(yīng)用SPSS13.0對數(shù)據(jù)進行方差分析，P≤0.05表示差異顯著。使用2△△Ct法對感染后不同時間的toll樣受體分子進行比對。

△△Ct＝（Ct目的基因－Ct看家基因）×試驗組－（Ct目的基因－Ct看家基因）×對照組

2－△△Ct表示的是試驗組目的基因表達對于對照組的變化倍數(shù)。

3 結(jié)果與分析

3.1 β－actin、TLR3、TLR4 和 TLR15 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 以10倍系列稀釋的β－actin、TLR3、TLR4和TLR15的陽性cDNA標(biāo)準(zhǔn)品為模板進行real－time PCR，得到檢測用 β－actin、TLR3、TLR4和TLR15的熒光定量PCR溶解曲線（圖1）和標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：

Y＝－4.017＊log（x）＋0.67，R2＝0.998；Y＝－4.128＊log（x）＋6.33，R2＝0.996；Y＝－4.097＊log（x）＋14.31，R2＝0.991；Y＝－4.089＊log（x）＋9.33，R2＝0.997

圖1 TLR3、TLR4、TLR15及 β－actin基因的SYBR Green I rea－l time PCR 溶解曲線

溶解曲線表明，擴增產(chǎn)物形成單一的特異性溶解峰，其Tm值介于82.6℃～87.6℃之間。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程表明，標(biāo)準(zhǔn)品起始模板濃度與Ct值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r2均達到0.991以上，且TLR3、TLR4和TLR15與β－actin曲線斜率值相差小于0.1，可用于β－actin、TLR3、TLR4和 TLR15的mRNA水平相對定量分析。

3.2 TLR3、TLR4和TLR15相對熒光定量結(jié)果分析 如圖2所示。與對照組相比，BBMC中TLR3的mRNA表達水平在IBDV感染后1d和感染后5 d均上調(diào)，差異顯著（P≤0.05），PBMC中僅在感染后1d顯著上調(diào)；感染后15dBBMC中TLR3恢復(fù)到正常水平，而PBMC中TLR3表達仍極顯著高于對照組（P≤0.01）。

差異顯著（P≤0.05），PBMC中 TLR4的 mRNA表達水平在感染后始終高于對照組，且在感染后15d極顯著高于對照組（P≤0.01）。BBMC中TLR15的mRNA表達水平在感染后1d顯著高于對照組（P≤0.05），感染后5d和15d無顯著差異；而PBMC中TLR15mRNA表達水平在感染后1d極顯著高于對照組（P≤0.01），在感染后5d和15d未檢測到。

圖2 感染后不同時間BBMC和PBMC中TLR3／4／15mRNA水平

4 討論

Toll樣受體是固有免疫中重要的識別受體，在機體識別各種病原微生物方面起著重要的作用。檢測Toll樣受體在感染初期（1dpi）、急性感染期（5dpi）與恢復(fù)期（15dpi）的 mRNA 表達水平變化，可探討IBDV感染對機體免疫反應(yīng)的影響。本試驗應(yīng)用實時熒光定量PCR方法，構(gòu)建了內(nèi)參基因β－actin及TLR3、TLR4、TLR15的標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用內(nèi)參基因β－actin消除mRNA的提取效率和反轉(zhuǎn)錄效率間的差異，結(jié)果可信度高，為檢測雞TLR3、TLR4、TLR15的表達水平提供了方法。

TLR3主要識別雙鏈RNA分子，在人類類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身性免疫性疾病中的表達上調(diào)［9］。劉爵等應(yīng)用間接免疫熒光和免疫印記技術(shù)驗證在TLR3基因沉默的細胞里，病毒VP2蛋白表達量下降，細胞中病毒滴度下降［10］，表明 TLR3在IBDV感染過程中起重要作用。本試驗中，BBMC和PBMC中TLR3mRNA表達水平在不同的時間段均表達上調(diào)，且差異顯著，推測TLR3可能在機體識別病毒中起作用。TLR4存在于多種細胞中，主要識別細菌的脂多糖，近年來有哺乳動物在病毒感染中TLR4表達量變化的報道［11］，證明TLR4在病毒的免疫防御中有重要作用，推測TLR4在禽類病毒感染中可能有相似的作用。本試驗中，BBMC和PBMC中，TLR4mRNA表達在急性感染期及恢復(fù)期均顯著上調(diào)，提示TLR4參與了IBDV感染過程中機體免疫系統(tǒng)的激活，IBDV感染后引起的腔上囊急性損傷可能與TLR4介導(dǎo)的炎性反應(yīng)有關(guān)。TLR15是禽類特有的Toll樣受體，有報道雞感染馬立克等病毒后也導(dǎo)致TLR15表達上調(diào)［12］。本試驗顯示，BBMC和PBMC中TLR15的mRNA表達水平在感染后1d均顯著高于對照組，表明TLR15在感染初期識別IBDV感染中起到重要作用。此后，TLR15在BBMC中恢復(fù)至正常水平，而在PBMC中未檢測到，提示IBDV感染后期PBMC中TLR15mRNA表達受到抑制。最近有報道，球蟲感染的雞腸道TLRs的表達下調(diào)可能導(dǎo)致雞腸道免疫功能紊亂，增加機體對其他疾病的易感性［13］，推測TLR15在IBDV感染中有相似的作用。

綜合分析表明，IBDV感染后雞腔上囊單個核細胞和外周血淋巴細胞中TLR3、4、15mRNA表達均有不同程度的上調(diào)，提示IBDV感染早期激活了機體的固有免疫反應(yīng)，發(fā)揮抗病毒作用，其識別病毒的機理及在免疫應(yīng)答中的作用有待于進一步研究。

［1］Lin Q，Li M，F(xiàn)ang D，etal.The essential roles of Toll－like receptor signaling pathways in sterile inflammatory diseases［J］.Int Immunopharmacol，2011，11（10）：1422－1432.

［2］Brownlie R，and B.Allan.Avian toll－like receptors［J］.Cell and Tissue Research，2010，343：121－130.

［3］Karpala A J，Lowenthal J W，Bean A G.Activation of the TLR3pathway regulates IFNβproduction in chickens［J］.Dev Comp Immunol，2008，32（4）：435－444.

［4］Hermann Müller，Md.Rafiqul Islam，Rüdiger Raue.Research on infectious bursal disease－the past，the present and the future［J］.Veterinary Microbiology，2003，97：153－165.

［5］Khatri M，Palmquist J M，Cha R M，etal.Infection and activation of bursal macrophages by virulent infectious bursal disease virus［J］.Virus Res，2005，113（1）：44－50.

［6］Poonia B，Charan S：Infiltration by CD4＋and CD8＋lymphocytes in bursa of chickens infected with Infectious Bursal Disease Virus（IBDV）：strain－specific differences［J］.Indian J Exp Biol，2004，42（8）：823－829.

［7］Li，Y.P.，D.D.Bang，K.J.Handberg，etal.Zhang.E－valuation of the suitability of six host genes as internal control in real－time RT－PCR assays in chicken embryo cell cultures infected with infectious bursal disease virus［J］.Vet Microbiol，2005，110：155－165.

［8］Livak K J，Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real－time quantitative PCR and the 2（－Delta Delta C（T））Method［J］.Methods.2001，25（4）：402－408.

［9］Takii Y，Nakamura M，Ito M，etal.Enhanced expression of type I interferon and toll－like receptor 3in primary biliary cirrhosis［J］.Lab Invest，2005，85（7）：908－920.

［10］施蕾，韋莉，劉爵.TLR3在雞傳染性法氏囊病病毒感染過程中的作用［A］.中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會禽病學(xué)分會第十四次學(xué)術(shù)研討會論文集［C］.北京：中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會，2008：139.

［11］Machida，K.，K.T.Cheng，etal.Hepatitis C virus induces toll－like receptor 4expression，leading to enhanced production of beta interferon and interleukin－6［J］.J Virol，2006，80：866－874.

［12］Heidari，M.，A.J.Sarson，M.Huebner，etal.Marek’s disease virus－induced immuno suppression：array analysis of chicken immune response gene expression profiling［J］.Viral Immunol，2010，23：309－19.

［13］Lindsay H.Sumners，Kate B.Miska，Mark C.Jenkins，et al.Expression of Toll－like receptors and antimicrobial peptides during Eimeria praecox infection in chickens［J］.Experimental Parasitology，2011，127：714－718.