吳鳳筍，李文剛，張桂云，王海花

（鄭州牧業(yè)工程高等?？茖W(xué)校，河南 鄭州450011）

副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，Hps）是引起豬革拉澤氏?。℅lasser′s disease）的病原菌，本菌寄生在豬的上呼吸道，通常定植在豬的鼻腔、扁桃體、氣管前段等部位。臨床上急性型感染表現(xiàn)為高熱，呼吸急促，呈腹式呼吸。慢性型表現(xiàn)為發(fā)病后期病豬進(jìn)行性消瘦，皮膚逐漸蒼白、發(fā)青、變紫，關(guān)節(jié)腫大，被毛粗亂，耳沿發(fā)紺。剖檢可見全身淋巴結(jié)腫大，心包積液和纖維素滲出性肺炎，嚴(yán)重者肺臟和胸腔有黏液，心肌與心包粘連呈絨毛心，關(guān)節(jié)腔及關(guān)節(jié)腔附近皮下，可見淺黃色膠凍狀水腫液（Aragon等，2010）。

豬是Hps的天然宿主，主要通過空氣傳播，該病一年四季均可感染，尤其是2～4周齡的仔豬和青年豬，發(fā)病率可高達(dá)10%～50%。副豬嗜血桿菌分為15種血清型，而且有20%以上的分離株不能分型。且不同血清型的Hps毒力不同，各血清型之間交叉免疫力較差，為該病的疫苗預(yù)防帶來很大的困難（陸承平，2001）。因此，對(duì)河南省6個(gè)市60個(gè)豬場進(jìn)行副豬嗜血桿菌病的情況調(diào)查，采集96份患多發(fā)性漿膜炎、纖維素性關(guān)節(jié)炎的疑似Hps感染病料進(jìn)行Hps的分離鑒定和生物學(xué)特性研究，獲得Hps河南省地方菌株流行血清型的分布、耐藥情況等信息，對(duì)預(yù)防和控制河南省Hps具有較大的臨床意義。

1 材料

1.1 主要試劑與儀器 胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）和胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB），購自中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD），購自北京索萊寶科技有限公司。馬血清購自浙江天杭生物科技有限公司；Hps血清型1～15的兔高免血清購自武漢科前動(dòng)物生物制品有限責(zé)任公司；TaKaRa PCR Amplification Kit，購自寶生物工程（大連）有限公司；各種微量生化鑒定管和藥物敏感試驗(yàn)紙片，購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 健康小鼠（約20g／只），購自河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)研究中心。

2 方法

2.1 調(diào)查方法 2011年3月至2012年2月，對(duì)河南周口、安陽、新鄉(xiāng)、濮陽、駐馬店、南陽等6個(gè)市60個(gè)豬場進(jìn)行副豬嗜血桿菌病流行病學(xué)調(diào)查，共采集了96份多發(fā)性漿膜炎、纖維素性關(guān)節(jié)炎的疑似Hps感染病料。

2.2 細(xì)菌分離 用無菌方法從肺臟、肝臟、脾臟、腹腔積液、關(guān)節(jié)液、心包液和腦組織等病料接種在含0.05%NAD和5%馬血清的TSA培養(yǎng)基上，置于5%CO2環(huán)境中37℃培養(yǎng)36～48h后觀察細(xì)菌菌落，再挑選單個(gè)菌落進(jìn)行純培養(yǎng)。

2.3 涂片鏡檢 挑取純培養(yǎng)的細(xì)菌涂片鏡檢，革蘭染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)。

2.4 生化鑒定 用無菌接種環(huán)挑取純培養(yǎng)的菌落，接種各種微量生化鑒定管進(jìn)行生化特性鑒定，在5%CO2環(huán)境中37℃培養(yǎng)36～48h后觀察并記錄結(jié)果。

2.5 血清型鑒定 將分離純化的菌株將分離純化的菌株接入TSB液體培養(yǎng)基，160r／min，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)12～36h，與Hps分型血清進(jìn)行玻片平板凝集試驗(yàn)，確定Hps血清型。

2.6 致病性試驗(yàn) 每株細(xì)菌取2只健康小鼠（20 g／只）進(jìn)行致病性試驗(yàn)。用純化的細(xì)菌每只小鼠腹腔注射0.5mL，連續(xù)觀察1周，每天記錄小鼠發(fā)病和死亡情況，并取死亡小鼠心臟、肝臟和脾臟等組織作細(xì)菌分離鑒定。

2.7 藥敏試驗(yàn) 采用紙片法，在無菌條件下將培養(yǎng)好的菌液涂勻于TSA培養(yǎng)基上，用鑷子夾取藥敏紙片貼于瓊脂平板，每個(gè)平板6張均勻分布。置于5%CO2環(huán)境中37℃培養(yǎng)24～36h后觀察并記錄測量結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果 2011年3月至2012年2月，對(duì)河南周口、安陽、新鄉(xiāng)、濮陽、駐馬店、南陽等6個(gè)市60個(gè)豬場進(jìn)行副豬嗜血桿菌病流行病學(xué)調(diào)查，共采集了96份疑似Hps感染病料。在調(diào)查的60個(gè)豬場中有25個(gè)豬場疑似Hps感染病料分離出Hps，這些病料都來自保育豬，表明該病主要感染幼齡豬。分離出的30株Hps中有25株是在6～11月分離出的，表明該病的發(fā)病主要在夏秋季節(jié)。采集的96份感染病料中有30份病料分離出Hps，分離率為31.25%，分離部位主要是肺臟和支氣管，肺臟、支氣管、關(guān)節(jié)液和心包滲出液的分離率分別為66.67%（20／30）、20.0%（6／30）、10.0%（3／30）和3.33%（1／30），這表明肺臟和氣管是 Hps的主要寄生器官。根據(jù)分離出來的菌株來源，可知安陽、新鄉(xiāng)、南陽3地區(qū)感染Hps最為嚴(yán)重。

3.2 細(xì)菌分離及染色結(jié)果 取病料在含0.05%NAD和5%馬血清的TSA培養(yǎng)基5%CO2環(huán)境中37℃培養(yǎng)36～48h，可見培養(yǎng)基上的細(xì)菌菌落呈圓形、針尖大小、呈灰白色和透明、表面光滑。取純培養(yǎng)36～48h的菌落涂片革蘭染色，光學(xué)顯微鏡下為革蘭陰性細(xì)小短桿菌，個(gè)別呈兩極濃染的球桿狀。

3.3 生化鑒定結(jié)果 將分離株接種于微量生化鑒定管在5%CO2環(huán)境中37℃培養(yǎng)36～48h，各項(xiàng)生化鑒定結(jié)果見表1。

表1 分離河南Hps生化鑒定結(jié)果

3.4 血清型鑒定結(jié)果 取純培養(yǎng)36h的菌株與Hps血清型1～15的兔高免血清進(jìn)行凝集試驗(yàn)，在鑒定的30株Hps中，血清4型6株，5型5株，9、11、13、14、15型各1株，有1株與2、9、10、13型血清均有凝集，其余13株未能定型。

3.5 致病性試驗(yàn)結(jié)果 將30株Hps分別接種小鼠并連續(xù)觀察1周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血清型5、13、14型菌株和5株未能定型的菌株能引起小鼠全部死亡，2株4型和2株未能定型菌株引起半數(shù)小鼠死亡；其余菌株不能引起死亡，小鼠僅在接種48h內(nèi)表現(xiàn)精神沉郁和食欲降低，之后恢復(fù)正常；從死亡小鼠的肺臟、肝臟和脾臟中均能分離到Hps。

3.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 30株Hps的藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表2。由表2可知，30株分離株對(duì)慶大霉素、頭孢喹諾、丁胺卡那霉素高度敏感；對(duì)土霉素、羅紅霉素、林可霉素、四環(huán)素中度敏感；對(duì)土霉素、氟本尼考、阿莫西林等不敏感。

表2 30株Hps藥敏試驗(yàn)結(jié)果

4 討論

副豬嗜血桿菌病是近年來嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的一種細(xì)菌性疾病，特別是在飼養(yǎng)管理?xiàng)l件不好的豬場往往造成保育豬的大量死亡。本調(diào)查對(duì)采集的96份疑似Hps感染病料進(jìn)行細(xì)菌分離，結(jié)果分離出30株Hps，分離率為31.25%，其中有83.33%的 Hps是在安陽、新鄉(xiāng)、南陽3個(gè)較大的生豬產(chǎn)區(qū)分離得到。表明Hps已成為一種在河南養(yǎng)豬場普遍流行的疾病。在調(diào)查中發(fā)現(xiàn)能分離到Hps的豬場，一般都有豬圓環(huán)病毒2型、豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒的感染。因此豬場應(yīng)做好這幾種免疫抑制性疾病的免疫，加強(qiáng)仔豬斷奶前后的保健工作，做好環(huán)境衛(wèi)生，加強(qiáng)通風(fēng)，減少豬群流動(dòng)，減少應(yīng)激，以減少副豬嗜血桿菌病的發(fā)生。

此外，部分患豬纖維素性或漿液性腦膜炎、胸膜炎、心肌炎、腹膜炎、關(guān)節(jié)炎、間質(zhì)性肺炎、心包炎的病料經(jīng)細(xì)菌分離并未分離到Hps，可能是其他病原引起的。再者，患病豬剛使用過抗生素治療或采集的樣品材料經(jīng)過冷凍不新鮮，也會(huì)導(dǎo)致分離不到Hps。

本次調(diào)查應(yīng)用Hps 1～15這15個(gè)血清型兔高免血清進(jìn)行凝集分型，結(jié)果13株Hps未能確定血清型，占43.33%。其中血清4型6株，5型5株，9、11、13、14、15型各1株，有1株與2、9、10、13型血清均有凝集。說明河南副豬嗜血桿菌病的主要血清型是4型和5型，與徐引弟等［3］、陸國林等［4］和周斌等［5］對(duì)河南、浙江和華東地區(qū)副豬桿菌病血清型的調(diào)查結(jié)果相似，表明中國目前副豬嗜血桿菌的主要血清型是4型和5型。未能確定血清型菌株的致病性、免疫原性及與其他血清型菌株的關(guān)系有待進(jìn)一步的研究。目前商品化的副豬嗜血桿菌疫苗主要是血清4型和5型，不同血清型之間交叉保護(hù)率低，這有可能導(dǎo)致副豬嗜血桿菌病的免疫失敗。因此，使用疫苗前應(yīng)進(jìn)行流行病學(xué)的調(diào)查，確定主要的血清型，采取相對(duì)應(yīng)的措施才能更有效地預(yù)防副豬嗜血桿菌病。

近年來，副豬嗜血桿菌病已成為規(guī)模化豬場主要的細(xì)菌性傳染病之一，發(fā)病豬的致死性使廣大養(yǎng)殖戶蒙受較大的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)也因其產(chǎn)生了對(duì)常規(guī)藥的耐藥性導(dǎo)致養(yǎng)殖場藥物成本的增加。此外，調(diào)查發(fā)現(xiàn)，部分豬場長期只使用某幾種抗生素，這樣極易使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。藥敏試驗(yàn)表明，Hps對(duì)在河南豬場常用的一些藥物的敏感性不高。因此，建議豬場在進(jìn)行藥物治療或保健時(shí)應(yīng)輪換使用藥物，避免細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。

［1］Aragon，Cerdà－Cuéllar M，F(xiàn)raile L，etal.Correlation between clinico－pathological outcome and typing ofHaemophilusparasuis field strains［J］.Vet Microbiol，2010，142（3～4）：387－393.

［2］陸承平.獸醫(yī)微生物［M］.3版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002.

［3］徐引弟，王治方，朱文豪，等.副豬嗜血桿菌高免血清的制備與應(yīng)用［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26（13）：14－16.

［4］陸國林，何海健.浙江省副豬嗜血桿菌的分離鑒定與藥敏試驗(yàn)［J］.中國獸醫(yī)科學(xué)，2010，40（6）：622－625.

［5］周斌，儲(chǔ)岳峰，李超，等.華東地區(qū)副豬嗜血桿菌的分離、血清型鑒定和藥敏分析［J］.畜牧與獸醫(yī)，2009，41（11）：84－86.