羅 金，劉光遠(yuǎn)，田占成，謝俊仁，沈 輝，田美媛

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 甘肅省動(dòng)物寄生蟲病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)部草食動(dòng)物疫病重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州730046）

馬泰勒蟲（Theileriaequi）作為引起馬梨形蟲病重要的病原之一，對(duì)馬屬動(dòng)物產(chǎn)業(yè)造成了很大的危害［1］。該病主要以發(fā)熱、貧血、淋巴結(jié)腫大為主要臨床癥狀，偶爾也有死亡案例的報(bào)道［2］。馬泰勒蟲的命名一直存在爭(zhēng)議，這給馬泰勒蟲病的臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查帶來(lái)了諸多不便。梨形蟲的鑒定與分類，主要分為傳統(tǒng)分類學(xué)和分子分類學(xué)［3］。傳統(tǒng)分類學(xué)依據(jù)病原形態(tài)、發(fā)病動(dòng)物臨床癥狀等條件進(jìn)行分類。但由于病原形態(tài)的局限，生活史較難追蹤，傳播媒介多樣性，種種弊端使傳統(tǒng)分類學(xué)存在一定的局限［4］。隨著分子技術(shù)的發(fā)展和高保守性基因的發(fā)現(xiàn)，分子分類學(xué)方法在物種的分類上應(yīng)用越來(lái)越廣。

本文通過對(duì)中國(guó)肇源株馬梨形蟲18SrRNA V4高變區(qū)核苷酸序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對(duì)陽(yáng)性質(zhì)粒測(cè)序。建立系統(tǒng)發(fā)生樹，分析進(jìn)化關(guān)系，同源性分析馬巴貝斯蟲與泰勒蟲及巴貝斯蟲之間的親緣關(guān)系，并以18SrRNA核苷酸一級(jí)結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，揭示該基因在分類學(xué)上的本質(zhì)。分析馬巴貝斯蟲的種屬性特異性，從而為馬巴貝斯蟲的分類提供進(jìn)一步的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 蟲體及試驗(yàn)動(dòng)物 本試驗(yàn)所用馬梨形蟲蟲株均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所蟲種資源保藏課題組提供。6～12月齡的馬匹，購(gòu)自于無(wú)馬梨形蟲病報(bào)道的地區(qū)。試驗(yàn)開始前馬匹被切除脾臟，并連續(xù)進(jìn)行病原學(xué)檢查，在無(wú)任何血液原蟲感染時(shí)才能用于試驗(yàn)。

1.2 蟲體基因組DNA提取及18SrRNA核苷酸V4高變區(qū)的擴(kuò)增 液氮保存的含蟲血液分別接種試驗(yàn)動(dòng)物，當(dāng)染蟲率達(dá)到5%以上，靜脈采血。取300μL蟲血，利用Gentra公司的DNA提取試劑盒，提取基因組。參考馬泰勒蟲（DQ287951）和駑巴貝斯蟲（FJ209026）18SrRNA基因序列進(jìn)行比對(duì)分析后在其V4高變區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物。Bc18SF 5′－GACTTAAACCCTCGCCAGA－3′，Bc18SR 5′－TATGGTTAGGACTACGACGGT－3′；Te18SF 5′－TTTGGGCTGTTTACAGTTGC－3′，Te18SR 5′－CTCAAAGTAAACGTCGAGTCATG－3′。PCR擴(kuò)增體系為去離子水37.5μL，10×PCR Buffer（含 Mg2＋）5μL，2.5 mmol／L dNTP混合液4μL，上下游引物各1μL，蟲體基因組DNA 1μL，rTaqDNA聚合酶（5U／μL）0.5μL。退火溫度56℃下進(jìn)行PCR。并將克隆到pMD19－T載體上的PCR產(chǎn)物送北京三博遠(yuǎn)志生物科學(xué)技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 序列比對(duì)和分析 測(cè)序所獲得的序列與Gen－Bank中登錄的不同梨形蟲的18SrRNA V4高變區(qū)（數(shù)據(jù)未顯示）進(jìn)行分析。用DNAStar軟件包中MegAlin對(duì)序列進(jìn)行分析。Clustal W方法對(duì)序列進(jìn)行對(duì)齊，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，并分析梨形蟲種內(nèi)及種間親緣關(guān)系。通過泰勒蟲與巴貝斯蟲核苷酸序列一級(jí)結(jié)構(gòu)特征，分析兩蟲種之間18SrRNA核苷酸序列的V4高變區(qū)的差異性。

2 結(jié)果

2.1 馬梨形蟲18SrRNA V4高變區(qū)擴(kuò)增及序列分析 PCR產(chǎn)物所得到的馬泰勒蟲和駑巴貝斯蟲18S rRNA V4高變區(qū)序列長(zhǎng)度分別為531bp和452bp。將該序列與GenBank中公布的部分梨形蟲18S rRNA核苷酸序列共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。顯示，泰勒蟲種和巴貝斯蟲種分屬兩大分支。在巴貝斯分支中，駑巴貝斯蟲種分為一支，犬巴貝斯蟲和分歧巴貝斯蟲構(gòu)成一支，二聯(lián)巴貝斯蟲作為單獨(dú)一支存在。泰勒蟲分支中存在兩個(gè)主要的分支。羊泰勒蟲和環(huán)形泰勒蟲有著較近的親緣關(guān)系，與中華泰勒蟲處于同一分支。而我國(guó)肇源株馬泰勒蟲與馬巴貝斯蟲在同一分支如圖1。

圖1 基于18SrRNA基因的梨形蟲系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.2 同源性分析 Clustal W方法比對(duì)試驗(yàn)中所測(cè)梨形蟲序列的同源性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，馬泰勒蟲（肇源株）和羊泰勒蟲、中華泰勒蟲、環(huán)形泰勒蟲、馬巴貝斯蟲的同源性分別為91.8%、91.0%、91.0%、96.4%。在巴貝斯科中，其種內(nèi)18SrRNA序列的同源性均高于93.0%，而駑巴貝斯（肇源株）蟲與犬巴貝斯蟲、雙芽巴貝斯蟲的同源性分別為93.3%、94.9%。

2.3 序列對(duì)齊分析 通過DNAStar軟件中的MegAlin對(duì)所研究的序列進(jìn)行對(duì)齊。顯示梨形蟲18SrRNA基因序列具有很高的保守性，僅V4高變區(qū)存在較大差異。值得注意的是巴貝斯蟲與泰勒蟲在一些區(qū)域存在較長(zhǎng)片段的缺失，或者某個(gè)基因的 缺失或變異見圖2。

圖2 馬泰勒蟲及泰勒蟲種和巴貝斯蟲種18SrRNA對(duì)齊分析。補(bǔ)充及序列差距用O表示，核苷酸置換相關(guān)性用□表示

3 討論

長(zhǎng)期以來(lái)馬泰勒蟲的分類一直存在爭(zhēng)議。以往的文獻(xiàn)及教科書中都將其命名為馬巴貝斯蟲，認(rèn)為馬泰勒蟲屬于巴貝斯科、巴貝斯屬。我國(guó)對(duì)馬泰勒蟲的分類研究主要建立于傳統(tǒng)分類方法（包括病原的形態(tài)、致病性、傳播媒介與傳播方式、生活史等）基礎(chǔ)上［5］。然而馬梨形蟲相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)，難以追蹤的生活史使得馬梨形蟲的鑒定存在較大困難。分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展使人們能夠在分子水平上認(rèn)識(shí)病原，18SrRNA基因已在物種分類領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用［6］。18SrRNA作為梨形蟲最為保守的序列，在物種分類上具有重要意義。龔真莉（2010）［7］在我國(guó)首次利用ELISA方法對(duì)駑巴貝斯蟲和馬泰勒蟲進(jìn)行了鑒別，交叉反應(yīng)試驗(yàn)特異性良好，從而區(qū)分了馬梨形蟲兩個(gè)蟲株的分類學(xué)特征。該方法雖能很好對(duì)馬梨形蟲分型，但對(duì)其正確命名沒有闡述。Grandi G等［8］，通過間接熒光抗體技術(shù)和巢式 PCR（nPCR）方法對(duì)意大利北部地區(qū)的馬梨形蟲病情況進(jìn)行了調(diào)查。Georges K C等［9］以18SrRNA為靶基因，應(yīng)用反向線性印跡方法對(duì)馬泰勒蟲病的診斷方法進(jìn)行了評(píng)估。以上方法不同程度的說(shuō)明了當(dāng)?shù)伛R梨形蟲病的流行情況。但是都不能很好的對(duì)馬泰勒蟲進(jìn)行分類鑒定。Raksha Bhoora［10］以馬泰勒蟲表面裂殖子抗原基因（EMA1）為模板設(shè)計(jì)特異性引物，利用實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)馬泰勒蟲的基因型進(jìn)行了分析，從而得出馬泰勒蟲存在3個(gè)基因型的結(jié)論，但是至于泰勒蟲的隸屬于泰勒蟲蟲種還是巴貝斯蟲種，作者并沒有給出答案。羅金 等（2011）［11］利用Hsp70對(duì)我國(guó)馬梨形蟲在世界馬屬動(dòng)物梨形蟲中的分類學(xué)地位進(jìn)行了闡述。從而為馬巴貝斯蟲隸屬于泰勒蟲種的泰勒蟲科分類命名給出了證據(jù)。同年，羅金［12］利用18SrRNA基因再次對(duì)馬泰勒蟲的分類學(xué)特征進(jìn)行了研究，得出的結(jié)論與上述一致。

18SrRNA基因序列作為物種分類鑒定重要的靶標(biāo)序列，已經(jīng)得到廣大科研工作者的認(rèn)可，但是其分類鑒定的本質(zhì)是什么，還未曾報(bào)道。本試驗(yàn)選擇馬梨形蟲18SrRNA基因序列的V4高變區(qū)設(shè)計(jì)引物，通過PCR技術(shù)獲得該序列片段，并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，同時(shí)對(duì)梨形蟲之間的親緣關(guān)系做了進(jìn)一步的闡述，最終利用該序列的一級(jí)結(jié)構(gòu)特征對(duì)泰勒蟲和巴貝斯蟲之間的分類進(jìn)行了闡述，進(jìn)一步佐證了馬巴貝斯蟲隸屬于泰勒蟲科，泰勒蟲屬。系統(tǒng)發(fā)生結(jié)果顯示，泰勒蟲和巴貝斯蟲分為明顯的兩支。在巴貝斯蟲的分支中，駑巴貝斯蟲（肇源株）與美國(guó)株及西班牙株有較高的同源性，分別為98.4%、98.2%。馬泰勒蟲（肇源株）與西班牙蟲株親緣關(guān)系較近，其同源性為96.4%，而與南非株和蘇丹株高達(dá)98.3%。值得注意的是之前被稱為馬巴貝斯蟲的蟲種和馬泰勒蟲種在同一分支上，同源性為96.4%。以上結(jié)果表明，18SrRNA這種高度的保守性，在物種的分類鑒定方面有著重要的應(yīng)用價(jià)值。為進(jìn)一步闡明18SrRNA在不同物種間的分類學(xué)本質(zhì)。我們對(duì)不同梨形蟲18SrRNA核苷酸序列進(jìn)行對(duì)齊分析，結(jié)果顯示，在其序列的V4高變區(qū)巴貝斯蟲相對(duì)泰勒蟲有部分片段的缺失，一些位點(diǎn)的突變也是造成泰勒蟲和巴貝斯蟲種間差異的主要原因。馬巴貝斯蟲18SrRNA核苷酸一級(jí)結(jié)構(gòu)表明，其序列特征和泰勒蟲科、泰勒蟲屬序列特征基本一致，而與巴貝斯蟲存在較大差異。結(jié)合馬泰勒蟲和巴貝斯蟲病原形態(tài)、致病性、傳播方式等特點(diǎn)我們最終確定，馬巴貝斯蟲屬于泰勒蟲科，泰勒蟲屬。

［1］羅金，劉光遠(yuǎn)，田占成，等.馬梨形蟲病診斷技術(shù)的研究現(xiàn)狀［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2011，32（1）：99－104.

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