吳惠明，鄭瑞峰，郭 峰，靳興軍，傅彩霞，陳立本，韓 磊，杜 鵑，王玉田，李 佳

（北京市獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)診斷所，北京 朝陽(yáng)100101）

豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）的主要病原。除PMWS外，豬皮炎與腎病綜合征，豬呼吸道綜合征，繁殖障礙，肉芽腫性腸炎，壞死性淋巴腺炎，滲出性皮炎，先天性震顫等疾病也證實(shí)與PCV2感染有關(guān)［1］。

近年來(lái)，對(duì)PCV2遺傳變異情況的報(bào)道不斷增多。PCV2b基因型已取代PCV2a成為當(dāng)前的優(yōu)勢(shì)基因型毒株［2］；PCV2基因組多為1 767nt或1 768 nt，而近年來(lái)有文獻(xiàn)相繼報(bào)道了基因組為1 766nt的新毒株［3－5］。為了了解當(dāng)前北京地區(qū)感染豬群中PCV2的基因變異情況，為PCV2的分子流行病學(xué)、感染及預(yù)防控制提供參考，本研究對(duì)2010年北京地區(qū)的PCV2PCR檢測(cè)核酸陽(yáng)性的病料進(jìn)行PCV2分離鑒定，并與GenBank登錄的序列進(jìn)行了同源性比較、構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，確定了分離毒株的基因型。

1 材料與方法

1.1 試劑及細(xì)胞株 ExTaqDNA聚合酶、dNTPs、DL－2 000DNA Marker，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；DNA提取試劑盒，購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；PCV1和PCV2PCR檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司；PCV陰性PK15細(xì)胞為農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)診斷中心惠贈(zèng)；DMEM、新生牛血清，購(gòu)自Hyclone公司；D－Glucosamine、辣根過(guò)氧化物酶葡萄球菌A蛋白標(biāo)記物、AEC購(gòu)自Sigma公司；特異性抗PCV2抗血清，購(gòu)自VMRD公司。

1.2 病料及PCR檢測(cè) 病料采自2010年北京平谷等地規(guī)模化豬場(chǎng)具有PMWS臨床癥狀的病豬的淋巴結(jié)、肺臟和脾臟組織。病料按照PCV1和PCV2PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 病毒的分離及鑒定 取PCR檢測(cè)為PCV1陰性且PCV2陽(yáng)性的組織病料樣品，按1∶10（W／V）加入DMEM培養(yǎng)液，將組織研磨后，凍融3次、離心取上清液，過(guò)濾除菌。通過(guò)用D－氨基葡萄糖處理PK15細(xì)胞促進(jìn)PCV2繁殖和分離［6］。用IPMA方法對(duì)分離的病毒進(jìn)行鑒定，IPMA操作方法參照文獻(xiàn)［7］。

1.4 全基因組序列的測(cè)定與分析 參考文獻(xiàn)［5］合成兩條引物PCV2－F（5′－ATCCACGGAGGAAGGGGGCCAGTT－3′）和 PCV2（5′－GTGGATTGTTCTGTAGCATTCTTCCA－3′），提取病毒培養(yǎng)物 DNA，擴(kuò)增全基因組序列。擴(kuò)增條件為預(yù)變性94℃5min；94℃30s，62℃1min，72℃2min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定。將PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。用DNAStar軟件包進(jìn)行全基因組核苷酸同源性分析。用MEGA5進(jìn)行PCV2ORF2序列比對(duì)，并使用Neighbor－Joining算法生成系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。最后，根據(jù)PCV2ORF2序列之間的遺傳距離假定閾值0.035為標(biāo)準(zhǔn)劃分基因型［8－10］。

2 結(jié)果

2.1 PCR檢測(cè)結(jié)果 采自北京平谷等地的2份病料樣品中均擴(kuò)增出為1 154bp的目的條帶，表明PCV2檢測(cè)為陽(yáng)性，PCV1陰性。

2.2 病毒分離鑒定結(jié)果 將經(jīng)處理的兩份組織勻漿，同步接種到PK15細(xì)胞后72～120h，沒(méi)有出現(xiàn)細(xì)胞病變，盲傳4代。應(yīng)用IPMA檢測(cè)F5代病毒時(shí)，可見(jiàn)接種的兩份分離毒株P(guān)K15細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)特異性紅棕色沉淀，而空白對(duì)照細(xì)胞內(nèi)無(wú)紅棕色沉淀，說(shuō)明接種病毒的PK15細(xì)胞內(nèi)有PCV2增殖，待檢病毒為PCV2。兩個(gè)毒株分別命名為BJ2010LC株和BJ2010PG株。圖1為BJ2010LC株IPMA試驗(yàn)結(jié)果，圖2為BJ2010PG株IPMA試驗(yàn)結(jié)果，圖3為IPMA試驗(yàn)空白對(duì)照細(xì)胞。

圖1 BJ2010LC株IPMA試驗(yàn)結(jié)果（200×）

2.3 全基因組序列分析 病毒培養(yǎng)物PCR擴(kuò)增獲得1 800bp左右目的條帶。PCR產(chǎn)物測(cè)序顯示，分離的2株P(guān)CV2全基因組序列均為1 767bp，已錄入GenBank中，BJ2010LC株登錄號(hào)為JQ002671，BJ2010PG株登錄號(hào)為JQ002672。兩株病毒ORF2長(zhǎng)度均為705bp。BJ2010PG株ORF2有兩個(gè)終止密碼子，編碼233個(gè)氨基酸；BJ2010LC株ORF2編碼234個(gè)氨基酸。序列同源性比較表明，本研究分離的2個(gè)PCV2分離株與10個(gè)PCV2株間的同源性為94.2%～99.5%。參與比較的毒株中，3個(gè)毒株分別為PCV2aPCV2bPCV2c的參考毒株，6株分別為2004年至2009年分離至北京的PCV2毒株。其中，BJ2010PG毒株與AF005394（PCV2b參考毒株）和BJ0401同源性較高，分別為99.5% 和 99.3%。BJ2010LC 毒株與 BDH 和BJ0901b同源性較高，均為99%。本次分離獲得的2個(gè)毒株之間的同源性為96.6%。

2.4 遺傳進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建和分離毒株基因分型 參考文獻(xiàn)［8－10］，利用 MEGA5的 Neighbor－Joining法將所分離2株P(guān)CV2的ORF2序列分別與PCV2a PCV2bPCV2c基因型參考毒株進(jìn)行比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，上述毒株分為四個(gè)基因型，分別為 PCV2a、PCV2b、PCV2c和PCV2d。分離毒株BJ2010LC株屬于PCV2d基因型，BJ2010PG屬于PCV2b基因型。

圖4 PCV2ORF2基因序列構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹(shù)

3 討論

對(duì)于PCV2基因型的劃分和命名，不同的研究組織常使用不同的劃分標(biāo)準(zhǔn)和名稱(chēng)［5，9，11］。針對(duì)這種情況，2008年歐盟PCVD聯(lián)合會(huì)（www.pcvd.eu）推薦通過(guò)遺傳進(jìn)化分析的方法對(duì)PCV2進(jìn)行基因型命名，將PCV2基因型命名為PCV2a、PCV2b、PCV2c，并且分別將GenBank中最早的報(bào)道的原型毒株AF055392和AF055394分別作為PCV2a和PCV2b參考株，將20世紀(jì)80年代只有在丹麥發(fā)現(xiàn)的PCV2EU148503作為PCV2c的參考株。該方法根據(jù)序列間遺傳距離（p－distance）不同進(jìn)行分類(lèi)，對(duì)PCV2ORF2序列進(jìn)行比對(duì)，劃分不同PCV2基因型的遺傳距離假定閾值設(shè)為0.035［8］。Ge X 等［10］依據(jù)此方法對(duì)我國(guó)2001至2010年的68株P(guān)CV2進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，這些毒株中無(wú)PCV2c，有PCV2a、PCV2b和PCV2d。其中PCV2d是依據(jù)該方法劃分出來(lái)的又一新基因型。PCV2d基因型毒株的特點(diǎn)是CAP基因終止密碼子發(fā)生突變，導(dǎo)致ORF2變?yōu)?05nt［10］。

本研究分離得到兩株P(guān)CV2，其中BJ2010LC株屬于PCV2d基因型，BJ2010PG屬于PCV2b基因型。Ge X 等［10］指出，北京地區(qū)存在PCV2a、PCV2b、PCV2d三種基因型毒株。PCV2b已成為我國(guó)優(yōu)勢(shì)基因型，而PCV2d在我國(guó)北京、河北、山東、江西等11個(gè)省市存在［10］。

ORF2是PCV2變異最大的一個(gè)開(kāi)放閱讀框，有四種長(zhǎng)度，分別為696bp、702bp、705bp和708bp，分別編碼231、233、234（或233）個(gè)氨基酸和235個(gè)氨基酸。ORF2基因是主要的結(jié)構(gòu)蛋白基因，編碼病毒的衣殼蛋白，多數(shù)PCV2毒株的ORF2為702 bp［10，12］。BJ2010PG 和 BJ2010LC 株 ORF2 長(zhǎng) 度 為705bp。BJ2010PG有兩個(gè)終止密碼子，編碼233個(gè)氨基酸；BJ2010LC株編碼234個(gè)氨基酸。而ORF2長(zhǎng)度的不同對(duì)其功能的影響還有待進(jìn)一步研究。

［1］Chae C.A review of porcine circovirus 2 associated syndromes and diseases［J］.Vet J，2005，169（3）：326－336.

［2］Guo L J，Lu Y H，Wei Y W，etal.Porcine circovirus type 2（PCV－2）：genetic variation and newly emerging genotypes in China［J］.Virol J，2010，7：273.

［3］Dupont K，Nielsen E O，Bakbo P，etal.Genetic analysis of PCV2isolates from Danish archives and a current PMWS casecontrol study supports a shift in genotypes with time［J］.Vet Microbiol，2008，128：56－64.

［4］Shang S B，Jin Y L，Jiang X T，etal.Fine mapping of antigenic epitopes on capsid proteins of porcine circovirus and antigenic phenotype of porcine circovirus type 2［J］.Mol Immunol，2009，46（3）：327－334.

［5］郭龍軍，陸月華，危艷武，等.我國(guó)部分地區(qū)豬圓環(huán)病毒2型分離株的遺傳變異分析［J］.中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，31（11）：856－859.

［6］Tischer I，Peters D，Rasch R，etal.Replication of porcine circovirus：induction by glucosamine and cell cycle dependence［J］.Arch Virol，1987，96（1－2）：39－57.

［7］Liu C，Ihara T，Nunoya T，etal.Development of an ELISA based on the baculovirus－expressed capsid protein of porcine circovirus type 2as antigen［J］.J Vet Med Sci，2004，66（3）：237－42.

［8］Segales J，Olvera A，Grau－Roma L，etal.PCV－2genotype definition and nomenclature［J］.Vet Rec，2008，162（26）：867－868.

［9］Grau－Roma L，Crisci E，Sibila M，etal.A proposal on porcine circovirus type 2（PCV2）genotype definition and their relation with postweaning multisystemic wasting syndrome（PMWS）occurrence［J］.Veterinary Microbiology，2008，128（1－2）：23－35.

［10］Ge X，Wang F，Guo X，etal.Porcine circovirus type 2and its associated disease in China ［J］.Virus Res，2012，164（1－2）：100－106.

［11］Hamel A L，Lin L L，Sachvie C，etal.PCR detection and characterization of type－2porcine circovirus［J］.Can J Vet Res，2000，64：44－52.

［12］王文秀，呂素芳，朱輝，等.兩株豬圓環(huán)病毒2型的分離及基因組序列分析［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2011，32（9）：5－9.