趙文婧，魯 承，黃京愛，王暖成，樸相哲

（1.延邊大學農(nóng)學院動物醫(yī)學系，吉林 延吉133000；2.吉林省延吉市畜牧防疫站，吉林 延吉133000；3.吉林省延吉市動物衛(wèi)生檢疫站，吉林 延吉133000）

小鵝瘟是由小鵝瘟病毒（GPV）引起的主要侵害4～20日齡雛鵝的一種烈性傳染病，該病病程短，傳染性強，死亡率高，給養(yǎng)鵝業(yè)造成了嚴重的危害。是由我國學者方定一于1956年在江蘇揚州首次發(fā)現(xiàn)的［1］。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，VP3基因是小鵝瘟病毒核衣殼的主要成分，約占總蛋白含量的80%，具有較高的保守性，能夠誘導機體產(chǎn)生中和抗體，是GPV主要保護性抗原［2］。本試驗旨在克隆與表達小鵝瘟VP3基因，為進一步研制單克隆抗體和基因工程疫苗奠定一定基礎。

1 材料與方法

1.1 病毒與菌種 GPV 為本實驗室從延邊某養(yǎng)鵝場發(fā)生小鵝瘟的病死鵝脾臟中分離。大腸埃希菌DH5α、BL－21、pGEX－4T－1菌株由本實驗室保存。

1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ、DNA凝膠回收試劑盒、ExTaq，均購自寶生物工程（大連）有限公司，其他為國產(chǎn)分析純。

1.3 引物的設計與合成 根據(jù)GenBank發(fā)表的小鵝瘟病毒（GPV）B株全基因序列，針對VP3基因保守區(qū)，利用Oligo 6.0和Primer Premier 5.0軟件設計合成了1對引物，由寶生物工程（大連）有限公司合成，擴增片段長度為1 457bp，下劃線為BamHⅠ、XhoⅠ酶切位點，序列如下：

1.4 DNA的提取 DNA的提取按文獻［3］方法進行。

1.5 PCR擴增 反應體系：ddH2O：12.3μL，10xPCR Buffer：2μL，dNTP：1μL，P1：1μL，P2：1μL，DNA：2.5μL，ExTaq：0.2μL。

反應程序：95℃預變性5min，94℃變性1min，53℃退火45s，72℃延伸2min，進行35個循環(huán)，最后于72℃再延伸5min。

取5μL PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 克隆質(zhì)粒pMD－VP3的構(gòu)建及鑒定 用DNA凝膠回收試劑盒進行純化回收VP3基因片段并將該片段與克隆載體pMD－18Tsimple連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞。挑取陽性克隆子接種于Amp／LB中，220r／min 37℃過夜，提取重組質(zhì)粒后分別進行PCR及酶切鑒定。鑒定正確后送往上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司進行序列測定。

1.7 重組表達質(zhì)粒的pGEX－VP3的構(gòu)建及鑒定將鑒定正確的pMD－VP3經(jīng)BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切后，將目的片段亞克隆至pGEX－4T－1中，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒的pGEX－VP3。并將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21感受態(tài)細胞中，經(jīng)PCR和雙酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送往上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司進行測序鑒定。

1.8 重組質(zhì)粒的誘導表達 將已經(jīng)鑒定為陽性的重組菌，用1mmol／L的IPTG進行誘導表達。分別在2、4、6、8h取樣，應用SDS－PAGE電泳對蛋白的表達情況進行檢測。

1.9 Western－blot分析 將表達的蛋白進行SDSPAGE后轉(zhuǎn)印至NC膜上，一抗為1∶200稀釋的小鵝瘟陽性兔血清，二抗為1∶2 000稀釋的HRP－羊抗兔IgG，進行 Western－blot分析。

1.10 包涵體的鑒定 按每克濕菌加入3mL PBS，反復凍融3次。采用超聲裂解法，裂解后的菌液4℃12 000r／min 5min。上清、沉淀分別進行SDSPAGE電泳，檢測重組蛋白存在形式。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，在1 457bp處出現(xiàn)目的條帶，與預期片段大小相符（見圖1）。

2.2 克隆質(zhì)粒的PCR鑒定 將提取的克隆質(zhì)粒進行PCR鑒定，在1 457bp處有一清晰的條帶，與預期片段大小一致（見圖2）。

2.3 克隆質(zhì)粒的酶切鑒定 克隆質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切得到兩條特異性基因片段，1條約為1 457bp，另1條約為2 700bp，所得結(jié)果與理論值相符（見圖3）。測序結(jié)果表明，克隆的目的片段與GenBank中的核苷酸序列同源性為96.8%，證明成功地克隆了小鵝瘟VP3基因。

2.4 重組質(zhì)粒pGEX－VP3的PCR鑒定及酶切鑒定 用1.5%瓊脂糖凝膠分析PCR產(chǎn)物，結(jié)果擴增出一條1 457bp的目的條帶，將重組表達質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ酶切鑒定，得到了約4 900bp和1 457bp兩條條帶，得到的片段與預期片段相符（見圖4）。序列測定結(jié)果顯示，氨基酸序列與克隆序列結(jié)果一致。經(jīng)DNAMAN分析及BLAST進行同源性比較，氨基酸的同源性為96%。

2.5 重組質(zhì)粒的誘導表達 經(jīng)12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，在81ku處有一條特異蛋白條帶，與預期的蛋白分子量大小一致。重組菌株37℃誘導表達8h的表達量最高（見圖5）。

2.6 Western－blot分析 表達產(chǎn)物轉(zhuǎn)至NC膜上后，與小鵝瘟陽性血清反應，在81ku處出現(xiàn)1條陽性反應帶。表明該蛋白為小鵝瘟特異性蛋白且具有很好的反應原性。

2.7 蛋白存在形式的鑒定 由圖6可見，重組蛋白大部分以包涵體的形式存在于沉淀中，上清液中較少。

圖6 重組菌裂解后上清與沉淀的SDS－PAGE電泳

3 討論

GPV屬于細小病毒科、細小病毒屬成員，核酸為單鏈、線性DNA，約為5 000bp，其中VP3基因全長1 605bp，編碼534個氨基酸。通過對基因組的結(jié)構(gòu)分析表明具有高度的保守性，具有較好的免疫原性［4］。

本試驗采用的原核表達系統(tǒng)異源蛋白具有細菌生長快、菌體密度高、成本相對低廉、操作方法簡便等優(yōu)點［5］。大腸桿菌的全部基因序列測定工作已完成，遺傳背景清楚，在多數(shù)科研工作中是蛋白表達的首選宿主［6－9］。本試驗為了提高外源基因表達的穩(wěn)定性和產(chǎn)量，采用了融合表達蛋白載體pGEX－4T－1。載體的SD（Shine－Dalgarno）序列及核糖體結(jié)合位點（RBS）對基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯效率有很大的影響，而pGEX質(zhì)粒的多克隆位點位于GST基因之后，因此不會改變載體的SD序列及RBS。蛋白純化條件溫和，可以直接從細菌裂解液中用固定化谷胱甘肽將它吸附，無變性劑的加入，最大限度地保持了蛋白的天然構(gòu)象，有利于保持蛋白活性。小鵝瘟VP3基因重組蛋白主要是以包涵體形式存在，重組蛋白以包涵體形式表達常可避免細胞內(nèi)蛋白水解酶的作用，增加了產(chǎn)物的穩(wěn)定性，有利于目的蛋白的富集和純化。

目前本病的防治主要靠疫苗免疫和卵黃抗體、抗血清，其中疫苗免疫主要以弱毒疫苗為主，但在生產(chǎn)實踐中效果不夠理想，因此，研制新型疫苗具有廣闊的發(fā)展前景。本研究成功表達了小鵝瘟病毒主要保護性抗原VP3基因，為進一步研制單克隆抗體和基因工程疫苗奠定一定基礎。

［1］方定一.小鵝瘟介紹［J］.中國畜牧獸醫(yī)雜志，1962，8：19－20.

［2］Richard E G.Diseases of poultry［M］.11st ed.Ames：Iowa State University Press，2003：367－374.

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［4］邢明偉，王君偉，賀云霞.鵝細小病毒NS2基因的克隆與序列分析［J］.中國預防獸醫(yī)學報，2003（3）：9.

［5］Kroos L，Maddock J R.Prokaryotic Development：Emerging Insights［J］.J Bacteriol，2003，185（4）：1128－1146.

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［7］Balbas P.Understanding the art of producing protein and nonprotein molecules in Escherichia coli［J］.Mol Biotechnol，2001，19（3）：251－267.

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