張西云，范玉霞，胡國元，李生慶，李秀萍

（青海省畜牧獸醫(yī)科學院，青海 西寧810016）

青海省海北州祁連縣默勒鎮(zhèn)2006～2008年綿羊發(fā)生持續(xù)死亡，死亡數(shù)達6 554只，發(fā)病前，該地區(qū)每年3～4月用羊三聯(lián)苗免疫羊群，但仍然有大量羊只發(fā)生死亡，經(jīng)我室確診為腸毒血癥后，采用產(chǎn)氣莢膜梭菌標準菌株C60－2（D型），采用優(yōu)化的培養(yǎng)基配方使該菌的產(chǎn)毒能力提高到3萬MLD／mL，制成羊腸毒血癥菌苗后2009年、2010年在青海祁連默勒地區(qū)免疫綿羊105 000只，結果免疫羊群均未發(fā)生本病。為該地區(qū)羊腸毒血癥的發(fā)生和流行提供了有效的菌苗，很大程度上減少了牧民的經(jīng)濟損失。

1 材料

標準的產(chǎn)氣莢膜梭菌C60－2菌株（來自中國獸醫(yī)藥品檢查所）；VF培養(yǎng)基（本室自制）；健康家兔1.5～2kg購自樂都種兔場；16～20g小鼠購自地方病研究所；甲醛；氫氧化鋁膠（本室自制）。

2 方法

2.1 基礎液制備 將產(chǎn)氣莢膜梭菌標準菌株C60－2（D型）接種到加生肝的V.F培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，用16～20g小鼠測定毒力。

將培養(yǎng)24h的種子培養(yǎng)物接種至1萬mL的大瓶中，37℃培養(yǎng)24h。

2.2 最小致死量測定 吸取大瓶24h培養(yǎng)物1mL，加含2.5g／L胰酶的1%碳酸鈉溶液1mL，37℃活化45min，5 000r／min離心15min，上清用生理鹽水10倍遞減稀釋，每一稀釋度靜脈注射小鼠2只（0.2mL／只）。觀察記錄結果。

2.3 脫毒 按菌液量的1%加入甲醛后密封，37℃～38℃殺菌脫毒14d，每d充分振蕩2次。將脫毒后的樣品接種至加生肝的厭氣肝湯、普通肉湯、普通斜面上［1］，37℃培養(yǎng)7d觀察記錄。

2.4 安全檢驗 將脫毒后的樣品經(jīng)胰酶活化離心，上清靜脈注射體重16～20g小鼠2只，每只0.4 mL，觀察記錄結果。結果：基礎液最小致死量為3萬MLD／mL；無菌檢驗，加生肝的厭氣肝湯、普通肉湯及普通斜面培養(yǎng)基上均無菌生長；脫毒的樣品經(jīng)胰酶活化離心，上清注射的小鼠健活，脫毒完全。

2.5 制苗 經(jīng)滅活、脫毒檢驗合格的基礎液，用銅紗濾過，用于配苗。先將檢驗合格的D型產(chǎn)氣莢膜梭菌的脫毒基礎液按基礎液4份加鋁膠1份的比例，加入滅菌的氫氧化鋁膠，再按全部容量的0.01%加入硫柳汞充分混合。

制苗完成后，取樣做無菌檢查，經(jīng)無菌檢驗合格后，充分混合，定量分裝。

2.6 菌苗檢驗 本品靜置后，上層為黃褐色澄明液體，下層為灰白色的沉淀，振搖后呈均勻混懸液。

無菌檢驗：將菌苗接種至生肝的厭氣肝湯、普通肉湯、普通斜面培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)7d均無菌生長。

安全檢驗：用體重1.5～2kg家兔4只，各肌肉注射菌苗5mL，觀察14d。未見明顯不良反應，注射部位有蠶豆大硬結。

效力檢驗：取1.5～2kg家兔20只，隨機分成4組，免疫組15只，均為皮下注射；對照組5只。飼養(yǎng)至18d，靜脈攻毒，觀察菌苗保護情況。結果見表1。

表1 菌苗保護情況

2.7 苗的現(xiàn)地使用 2009年6月初在祁連默勒地區(qū)用該苗進行小群免疫試驗，免疫羊只20只，觀察21d，未見不良反應，2009年7月初及2010年7月初在該地區(qū)分別免疫羊只6.5萬只和4萬只，疫苗用時搖勻，不論羊只年齡大小，肌肉或皮下注射2mL。2009年及2010年免疫羊只均未發(fā)生羊腸毒血癥病。

3 結果與討論

通過菌苗的安檢、效檢及現(xiàn)地使用，證明該苗安全有效，是預防綿羊腸毒血癥的可靠菌苗。為解決祁連默勒地區(qū)使用羊三聯(lián)苗后仍發(fā)生羊腸毒血癥的現(xiàn)狀提供了保障。