馮少珍，李 嬌，吳曉嬋，曹偉勝，廖 明

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州510642）

J亞群禽白血病病毒（Subgroup J avian leukosis virus，ALV－J）屬于禽α反轉(zhuǎn)錄病毒屬。Payne等在1991年首次在肉雞中發(fā)現(xiàn) ALV－J［1］，我國(guó)在1999年證實(shí) ALV－J的存在［2－3］，2002年，首次發(fā)現(xiàn)蛋雞存在J亞群禽白血?。?－5］。但不到10年的時(shí)間，全國(guó)已有相當(dāng)多的雞場(chǎng)發(fā)現(xiàn)該病，其主要臨床表現(xiàn)為骨髓瘤、血管瘤、淋巴瘤、纖維肉瘤等多種腫瘤［6］，造成雞群免疫抑制，并成為其他疾病的誘因。ALV－J可經(jīng)種蛋垂直傳播和水平傳播，先天感染的子代雞發(fā)生免疫耐受，導(dǎo)致免疫抑制。

長(zhǎng)末端重復(fù)序列（LTR）是反轉(zhuǎn)錄病毒基因組兩端的一段重復(fù)序列（5′LTR和3′LTR）。LTR與ALV的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、宿主范圍、組織細(xì)胞嗜性及致瘤譜系的改變有關(guān)［7－12］。為了探討LTR在骨髓瘤病變型ALV－J毒株NX0101產(chǎn)生免疫抑制中的作用，本試驗(yàn)通過反向遺傳和搭橋PCR方法拯救重組病毒，將血管瘤病變型毒株HN06中兩端的LTR序列替換至NX0101毒株的相應(yīng)位置，通過人工后天感染模型，研究ALV－J在試驗(yàn)雞體內(nèi)分布及造成機(jī)體和免疫器官損傷的狀況。

1 材料與方法

1.1 毒種和細(xì)胞 ALV－J骨髓瘤病變型NX0101克隆株由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院崔治中教授惠贈(zèng)。ALV－J HN06株分離自發(fā)生血管瘤病變的病雞內(nèi)臟，通過反向遺傳方法獲得HN06克隆株［13］。DF－1細(xì)胞和抗ALV－J gp85單克隆抗體JE9由揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院秦愛建教授惠贈(zèng)。

1.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 按照張紀(jì)元等報(bào)道的方法［14］，將 NX0101株前體基因組cDNA （GenBank登錄號(hào)DQ115805）克隆至載體pMDTM18－T中，獲得重組質(zhì)粒pMDNX0101。根據(jù)NX0101株和HN06株前體基因組序列設(shè)計(jì)特異性引物（表1），通過搭橋PCR方法將HN06株前體基因組兩端的LTR序列（5′端1－325bp，3′端7309－7633bp）分別替換至NX0101株前體基因組的相應(yīng)位置，獲得含有完整前體基因組結(jié)構(gòu)的重組質(zhì)粒pNX－HNLTR（圖1）。

表1 引物序列

圖1 重組質(zhì)粒pNX－HNLTR構(gòu)建

1.3 重組病毒NX－HNLTR株的拯救和鑒定 通過lipofectamineTM2000（Invitrogen公司），將重組質(zhì)粒pNX－HNLTR轉(zhuǎn)染至 DF－1細(xì)胞中，37℃，5%CO2培養(yǎng)3d后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清。經(jīng)免疫間接熒光（IFA）方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞以及經(jīng) ALV抗原ELISA檢測(cè)試劑盒（IDEXX）檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清均呈陽(yáng)性反應(yīng)者，收集細(xì)胞培養(yǎng)物上清作為連續(xù)傳代的接種物，并測(cè)定TCID50，病毒保存于－70℃。

按照賴漢漳報(bào)道的方法，利用抗ALV－J gp85單克隆抗體JE9對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行IFA檢測(cè)［13］，利用半定量方法對(duì)毒株進(jìn)行定量，按照Reed－Muench氏法計(jì)算病毒的細(xì)胞半數(shù)感染劑量（TCID50）。

1.4 動(dòng)物感染 7日齡SPF雛雞120只，隨機(jī)分為2個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，每組40只，隔離飼養(yǎng)。試驗(yàn)組分別通過人工腹腔接種104TCID50／0.2 mL的NX0101株和NX－HNLTR株，對(duì)照組不做任何免疫和攻毒。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)和方法

1.5.1 體重和胸腺、脾臟、腔上囊重量 每天觀察雞群生長(zhǎng)狀態(tài)，各組在攻毒后不同時(shí)間點(diǎn)分別測(cè)量體重，解剖觀察病變，并取胸腺、腔上囊和脾臟稱重，計(jì)算免疫器官指數(shù)：免疫器官指數(shù)＝免疫器官重量（g）／雞活體重（g）×100%。

1.5.2 組織病原學(xué)檢測(cè) 采取雞胸腺、脾、腔上囊等組織，提取總基因組DNA。按照Smith等方法［13］進(jìn)行PCR檢測(cè)病毒前體基因組整合水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5軟件分析，并采用t檢驗(yàn)法進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05作為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 重組病毒的拯救 通過搭橋PCR構(gòu)建重組質(zhì)粒pNX－HNLTR，PCR產(chǎn)物電泳和測(cè)序結(jié)果顯示獲得序列正確的片段。PCR擴(kuò)增片段經(jīng)過雙酶切后連接至載體pMDNX0101中，測(cè)序顯示HN06株基因組兩端的LTR基因完整替換至NX0101株基因組的對(duì)應(yīng)位置，獲得重組質(zhì)粒pNX－HNLTR。

重組質(zhì)粒pNX－HNLTR轉(zhuǎn)染 DF－1細(xì)胞，IFA檢測(cè)結(jié)果表明，大部分細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)特異熒光（圖2），說明獲得了ALV－J病毒粒子，克隆化重組病毒命名為NX－HNLTR。含有重組病毒NX－HNLTR的細(xì)胞培養(yǎng)物傳8代，每1代細(xì)胞培養(yǎng)物上清均用ALV抗原ELISA檢測(cè)試劑盒檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，S／P比值均＞0.2，呈陽(yáng)性，說明拯救的病毒粒子NX－HNLTR具有感染性。

圖2 重組質(zhì)粒pNX－HNLTR轉(zhuǎn)染DF－1細(xì)胞3d后的IFA結(jié)果

2.2 ALV－J感染對(duì)體重及免疫指標(biāo)的影響 如圖3所示，在試驗(yàn)期1周開始，NX0101攻毒組的平均體重明顯低于正常對(duì)照組，差異顯著（P＜0.05）。NX－HNLTR攻毒組的平均體重在試驗(yàn)期4周內(nèi)與對(duì)照組的差異不大，但6周時(shí)平均體重（199.5g）明顯低于對(duì)照組（283g）（P＝0.043）。

圖3 ALV－J感染后雞只體重的變化

免疫器官指數(shù)分析結(jié)果顯示（圖4），攻毒組的胸腺、腔上囊和脾臟在攻毒后6周時(shí)萎縮最嚴(yán)重，免疫器官指數(shù)都顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。試驗(yàn)期6周內(nèi)，NX0101攻毒組的胸腺指數(shù)和腔上囊指數(shù)都低于對(duì)照組，但差異不顯著（P＞0.05）；脾臟指數(shù)波動(dòng)較大，在2周時(shí)達(dá)到最高峰，隨后降低，6周時(shí)最小。NX－HNLTR攻毒組的脾臟指數(shù)在試驗(yàn)期內(nèi)均低于對(duì)照組，胸腺和腔上囊指數(shù)與對(duì)照組的相比，時(shí)高時(shí)低，規(guī)律不明顯。

圖4 7日齡雛雞感染ALV－J后免疫器官指數(shù)的動(dòng)態(tài)變化

2.3 組織病原學(xué)檢測(cè)和LTR對(duì)病毒感染的影響

PCR方法檢測(cè)ALV－J在免疫器官分布的結(jié)果顯示，感染NX0101株的雞，骨髓和脾臟在攻毒后3周能檢測(cè)到病毒基因，胸腺和腔上囊則在6周才能檢測(cè)到；感染NX－HNLTR株的雞在攻毒后2周，脾臟可以檢測(cè)到病毒基因，骨髓和胸腺分別在3周和6周時(shí)才可檢測(cè)到（圖5）。

3 討論

本試驗(yàn)將血管瘤病變型ALV－J毒株HN06中兩端LTR序列替換至骨髓瘤病變型ALV－J毒株NX0101的相應(yīng)位置，得到重組毒株NX－HNLTR。7日齡SPF雞接種病毒NX0101和NX－HNLTR后，體重低于正常對(duì)照組，接種病毒HN06的雞也出現(xiàn)體重下降的現(xiàn)象［16］，說明 ALV－J對(duì)雞體生長(zhǎng)有一定影響。接種了NX0101的雞，胸腺和腔上囊指數(shù)明顯低于正常對(duì)照組，胸腺和腔上囊的發(fā)育持續(xù)受到抑制。然而張利等［17］報(bào)道指出，接種了NX0101病毒（103TCID50）的雞在感染后2周時(shí)，體重和免疫器官指數(shù)增加，隨后在感染后5周內(nèi)持續(xù)降低。結(jié)果有所差異，可能與攻毒量不同以及雞只個(gè)體有差異有關(guān)。

圖5 ALV－J在各感染雞免疫器官的分布

從各免疫器官中病毒基因的整合情況來看，NX0101攻毒組和NX－HNLTR攻毒組在攻毒后2周和3周開始發(fā)現(xiàn)病毒基因整合至脾臟和骨髓基因組，胸腺和腔上囊在攻毒后6周時(shí)可檢測(cè)到，而HN06攻毒組則在1周就檢測(cè)到病毒基因整合至骨髓和脾臟，胸腺和腔上囊在攻毒后4周可檢測(cè)到［16］。造血器官脾臟和骨髓是最先檢測(cè)到病毒基因整合的，胸腺和腔上囊在攻毒后期才檢測(cè)到病毒基因整合，也就是說病毒很可能最先感染的免疫器官是脾臟和骨髓，隨后是胸腺和腔上囊。病毒基因整合至各器官的先后次序反映出病毒在免疫器官中的感染過程。研究表明，LTR與ALV的宿主范圍和組織細(xì)胞嗜性有關(guān)［7－9］，LTR可能影響不同病變型ALV－J毒株感染不同組織的先后順序。

［1］Payne L N，Brown S R，Bumstead N，etal.A novel subgroup of exogenous avian leukosis virus in chickens［J］.J Gen Virol，1991，72（Pt 4）：801－807.

［2］杜巖，崔治中，秦愛建.從市場(chǎng)商品肉雞中檢測(cè)出J亞群禽白血病病毒［J］.中國(guó)家禽學(xué)報(bào)，1999，3（1）：1－4.

［3］趙振華，顧玉芳，王風(fēng)龍，等.禽骨髓細(xì)胞瘤病的病理學(xué)初報(bào)［J］.動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究進(jìn)展，1999，20（3）：85－86.

［4］徐鑌蕊，董衛(wèi)星，何召慶，等.間接熒光抗體法快速診斷海蘭褐蛋雞J亞群禽白血病的研究［J］.中國(guó)獸醫(yī)雜志，2002，38（9）：7－9.

［5］Xu B，Dong W，Yu C，etal.Occurrence of avian leukosis virus subgroup J in commercial layer flocks in China ［J］.Avian Pathol，2004，33（1）：13－17.

［6］Cheng Z，Liu J，Cui Z，etal.Tumors associated with avian leukosis virus subgroup J in layer hens of during 2007to 2009 in China［J］.J Vet Med Sci，2010，72（8）：1027－1033.

［7］Hayward W S，Neel B G，Astrin S M.Activation of a cellular onc gene by promoter insertion in ALV－induced lymphoid leukosis［J］.Nature，1981，290（5806）：475－480.

［8］Payne G S，Bishop J M，Varmus H E.Multiple arrangements of viral DNA and an activated host oncogene in bursal lymphomas［J］.Nature，1982，295（5846）：209－214.

［9］Brown D W，Robinson H L.Influence of env and long terminal repeat sequences on the tissue tropism of avian leukosis viruses［J］.J Virol，1988，62（12）：4828－4831.

［10］Ruddell A.Transcription regulatory elements of the avian long terminal repeat［J］.Virology，1995，206（1）：1－7.

［11］Chesters P M，Howes K，Petherbridge L，etal.The viral envelope is a major determinant for the induction of lymphoid and myeloid tumors by avian leukosis virus subgroups A and J，respectively［J］.J Gen Virol，2002，83（10）：2553－2561.

［12］Tomioka Y，Ochiai K，Ohashi K，etal.In ovo infection with the ALV causing fowl glioma：the viral distribution and pathogenesis［J］.Avian Pathol，2003，32（6）：617－624.

［13］賴漢漳.血管瘤型禽白血病病原學(xué)研究及ALV感染性克隆構(gòu)建［D］.廣州：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文，2009：46－48.

［14］張紀(jì)元，崔治中，丁家波，等.J亞群白血病病毒NX0101株感染性克隆化病毒的構(gòu)建及其致病性［J］.微生物學(xué)報(bào)，2005，45（3）：437－440.

［15］Smith L M，Brown S R，Howes K，etal.Development and application of polymerase chain reaction（PCR）tests for the detection of subgroup J avian leukosis virus［J］.Virus Res，1998，54（1）：87－98.

［16］馮少珍，李嬌，吳曉嬋，等.血管瘤病變型ALV－J后天感染對(duì)雞免疫器官的影響［J］.中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2011，41（8）：784－788.

［17］張利，劉青，王曉偉，等.禽白血病病毒J亞群（ALV－J）免疫抑制特性研究［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，41（9）：1198－1202.