郭洪香 蔣靜思 劉 波 袁安文，2*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，長沙 410128；2.長沙綠葉生物科技有限公司，長沙 410125）

對于大多數(shù)哺乳動(dòng)物來說，陰囊內(nèi)睪丸的溫度比體溫低2～8℃，保證睪丸曲細(xì)精管內(nèi)的精子發(fā)生正常進(jìn)行。如果環(huán)境溫度升高至一定程度，睪丸溫度會隨體溫升高而超出最適溫度范圍，不利于精子形成[1]。睪丸溫度升高到38℃以上，會引起生殖上皮細(xì)胞變性，生精小管中的精子受到影響[2]。熱應(yīng)激能夠?qū)е虏G丸組織嚴(yán)重?fù)p傷[3]。溫度成為影響動(dòng)物繁殖性狀的重要因素之一。雖然研究不同溫度影響雄性睪丸已有報(bào)道，但從不同溫度和不同時(shí)間2個(gè)因素探索熱應(yīng)激對睪丸組織影響的研究卻很少。為此，我們以昆明小鼠為試驗(yàn)動(dòng)物，應(yīng)用小鼠睪丸熱應(yīng)激模型，觀察睪丸形態(tài)學(xué)變化規(guī)律。以探索不同時(shí)間不同溫度小鼠睪丸組織的耐受性，找到有害溫度及時(shí)間的極限，為進(jìn)一步研究熱應(yīng)激對雄性動(dòng)物生殖機(jī)能的影響，改善環(huán)境溫度和飼養(yǎng)管理?xiàng)l件，加強(qiáng)營養(yǎng)調(diào)控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：本實(shí)驗(yàn)選用8～9周雄性昆明小鼠，要求其臨床健康，自由飲食，飼養(yǎng)環(huán)境溫度10～20℃。

主要儀器與試劑：0.5%戊巴比妥鈉、10%福爾馬林、HE染液；電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司 DK-S24）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（南京實(shí)驗(yàn)儀器廠 HG303-3K）、體式顯微鏡（Motic SMZ-168）、生物顯微鏡（ZEISS Primo Star）、顯微攝像系統(tǒng)（MOTICAM 2306）、電子分析天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司 AE100S）、電子天平（長沙湘平科技發(fā)展有限公司 ES-5-HA）、切片機(jī)（ROTARY MICROTOME Reichert Histo STAT）

1.2 方法

實(shí)驗(yàn)分為3個(gè)大組，40℃熱處理組18只，（分為3個(gè)小組，各6只，分別放入40℃水中，水浴0.5 h，1 h以及1.5 h）；41℃熱處理組18只（分為3個(gè)小組，各6只，分別放入41℃水中，水浴0.5 h，1 h以及1.5 h）。對照組6只，進(jìn)行全身麻醉，不進(jìn)行熱應(yīng)激處理。用電子天平對實(shí)驗(yàn)雄鼠稱重，腹腔注射0.5%戊巴比妥鈉0.5～0.8 ml對小鼠進(jìn)行麻醉。參照Paul等[4]的方法將麻醉的小鼠后1/3（后肢、尾和陰囊）浸入設(shè)定溫度的電熱恒溫水浴鍋水中30 min，對小鼠睪丸進(jìn)行熱應(yīng)激處理。于熱處理后第7 d處死小鼠，處死前稱量體重。采集睪丸并稱重，睪丸放入中性福爾馬林液中固定，用于組織切片觀察。

1.2.1 睪丸系數(shù)的測定

參照肖漢洪等[5]的方法測定睪丸系數(shù)。睪丸系數(shù)=（睪丸重/體重）×100%；

1.2.2 睪丸組織石蠟切片的制作與觀察

將采集的小鼠睪丸在10%福爾馬林浸泡固定，24 h以后的組織用自來水浸泡沖洗，過夜。按照常規(guī)石蠟制作過程脫水、透明、浸蠟、包埋，切片（厚度4 μm）、HE染色；封片。用生物顯微鏡觀察睪丸組織切片中曲細(xì)精管、生殖細(xì)胞的形態(tài)變化情況，并用顯微攝像系統(tǒng)進(jìn)行顯微照相。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用EXCEL軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用SAS9.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱應(yīng)激對小鼠睪丸的影響

不同溫度不同時(shí)間熱處理后小鼠睪丸系數(shù)的變化情況見表1。相同溫度水浴處理時(shí)間不同，熱應(yīng)激對小鼠睪丸損傷情況不同。與對照組相比，40℃水浴處理0.5 h組睪丸指數(shù)變化不顯著，1 h組睪丸指數(shù)變化顯著，1.5 h組睪丸指數(shù)變化極顯著；40℃水浴處理組間，與0.5 h組比較，1 h組睪丸系數(shù)差異顯著，1.5 h組睪丸系數(shù)變化極顯著；1 h組與1.5 h組比較，差異極顯著。與對照組相比，41℃水浴處理組睪丸指數(shù)變化均為極顯著；組間比較差異不顯著。

表1 不同溫度不同時(shí)間水浴處理對小鼠睪丸系數(shù)的影響

同一列數(shù)字右側(cè)不同大寫字母表示差異極顯著（P＜0.01）；不同小寫字母表示差異顯著，（0.01＜P＜0.05）

2.2 睪丸組織形態(tài)觀察

不同溫度不同時(shí)間熱處理后小鼠睪丸組織形態(tài)。對照組（圖1G）生精小管內(nèi)各級生精細(xì)胞排列緊密，整齊有序，結(jié)構(gòu)清晰完整，細(xì)胞層數(shù)多，可見各個(gè)發(fā)育階段的精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、精細(xì)胞。與對照組比較，40℃0.5h水浴處理組（圖1A）沒有明顯變化。40℃1h水浴處理組（圖1B），細(xì)胞排列疏松無規(guī)則，細(xì)胞層數(shù)減少，精細(xì)胞和精母細(xì)胞減少。40℃1.5h水浴處理組（圖1C），生精細(xì)胞層數(shù)和數(shù)量減少，未見成熟精子，生精小管內(nèi)出現(xiàn)空泡化；41℃0.5h水浴處理組（圖1D），細(xì)胞排列紊亂，有多核巨細(xì)胞存在；41℃1h水浴處理組（圖1E），細(xì)胞層數(shù)和細(xì)胞數(shù)量明顯減少，小管腔少見或未見精細(xì)胞，有多核巨細(xì)胞存在；41℃1.5h水浴處理組（圖1F），生精細(xì)胞顯著減少，有些生精小管成為空腔。

3 討論

3.1 關(guān)于小鼠睪丸系數(shù)的變化

相同時(shí)間不同溫度或相同溫度不同時(shí)間處理組的小鼠睪丸系數(shù)差異顯著。40℃0.5 h熱應(yīng)激組與對照組比較，小鼠睪丸系數(shù)變化不明顯。1 h組睪丸系數(shù)變化顯著，1.5 h組睪丸系數(shù)變化極顯著；與對照組相比，41℃水浴處理組睪丸系數(shù)變化均極顯著。雄性動(dòng)物陰囊組織結(jié)構(gòu)與睪丸血管的逆熱流交換機(jī)制，使睪丸溫度低于體溫，成為精子發(fā)生的重要保證[6]。如果環(huán)境溫度超過小鼠自身調(diào)節(jié)溫度，睪丸局部受熱，陰囊的調(diào)節(jié)機(jī)制受到影響，引起睪丸組織缺氧，產(chǎn)生熱應(yīng)激反應(yīng)。初期機(jī)體大量出汗導(dǎo)致機(jī)體和含水量較多的器官如睪丸失水，睪丸質(zhì)量也會減輕。另外，熱應(yīng)激導(dǎo)致睪丸生精小管內(nèi)細(xì)胞減少，出現(xiàn)空泡化，也會導(dǎo)致睪丸質(zhì)量減輕。水浴處理對采樣小鼠體重影響不大，所以睪丸系數(shù)下降。隨著熱應(yīng)激時(shí)間的延長，小鼠睪丸重量下降，這與李德軍[7]等研究結(jié)果相吻合。

3.2 關(guān)于小鼠睪丸損傷情況

相同溫度不同時(shí)間組的小鼠睪丸損傷嚴(yán)重，曲細(xì)精管內(nèi)生殖細(xì)胞缺失，睪丸內(nèi)生殖細(xì)胞變性凋亡。這與叢霞研究結(jié)果相吻合[8]。40℃0.5 h熱應(yīng)激組與對照組比較，睪丸形態(tài)沒有明顯區(qū)別。Bank 等研究發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激會導(dǎo)致生殖細(xì)胞DNA損傷，進(jìn)而誘發(fā)生殖細(xì)胞發(fā)生凋亡[9]。41℃水浴處理組中，細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞層數(shù)減少，生精上皮空泡化，出現(xiàn)多核巨細(xì)胞，有些生精小管成為空腔。與Chaki 的研究結(jié)果相吻合。熱應(yīng)激引起生精細(xì)胞凋亡，尤其是精原細(xì)胞和精子細(xì)胞，這與Yin，Y研究一致[10]。小鼠體表面積相對比較大，汗腺不發(fā)達(dá)，通過呼吸散熱和代謝率下降以及耳血管擴(kuò)張加快散熱。陰囊組織結(jié)構(gòu)與睪丸血管的逆熱流交換機(jī)制，可以散熱，相對較低的溫度水浴處理，對小鼠睪丸組織的影響不是很大。睪丸局部溫度升高，生殖細(xì)胞新陳代謝加快，氧氣量不足，引起細(xì)胞周期紊亂甚至細(xì)胞凋亡[4]。水浴處理溫度越高時(shí)間延長，睪丸損傷越嚴(yán)重。

本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激導(dǎo)致睪丸質(zhì)量下降，生精細(xì)胞凋亡，影響精細(xì)胞的生成。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，相同溫度水浴處理時(shí)間越長或者相同時(shí)間水浴處理溫度越高，小鼠睪丸系數(shù)變化越顯著，睪丸損傷越嚴(yán)重。

[1]梁明振，黃桂花，何烽杰，et al.熱應(yīng)激對公兔精液品質(zhì)、睪丸組織形態(tài)及抗氧化指標(biāo)的影響[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，41（3）：263-265

[2]姜忠玲.熱應(yīng)激對小鼠附睪內(nèi)精子的形態(tài)學(xué)影響[J].黑龍江動(dòng)物繁殖，2009，17（1）：2-4

[3]田允波.熱應(yīng)激與奶牛繁殖機(jī)能[J].中國奶牛，1992（2）：22-25

[4]Paul，C.，A.A.Murray，N.Spears，et al.A single，mild，transient scrotal heat stress causes DNA damage，subfertility and impairs formation of blastocysts in mice[J].Reproduction，2008，136（1）：73-84

[5]肖漢洪，何耀明.熱應(yīng)激對小鼠精子發(fā)生及其性能的影響[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002（5）：134-136

[6]趙春生，呂文發(fā)，王恒，等.溫度對小鼠睪丸生精機(jī)能的影響[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，24（6）：78-81

[7]李德軍，田文儒，劉運(yùn)楓，等.熱應(yīng)激對鼠精液質(zhì)量影響的研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2010（5）：101-102

[8]叢霞，姜忠玲.熱應(yīng)激對雄鼠生殖器官及精子發(fā)生的影響[J].黑龍江動(dòng)物繁殖，2007，15（3）：4-6

[9]Banks，S.，S.A.King，D.S.Irvine，et al.Impact of a mild scrotal heat stress on DNA integrity in murine spermatozoa[J].Reproduction，2005，129（4）：505-14

[10]Yin，Y.，K.L.Hawkins，W.C.DeWolf，et al.Heat stress causes testicular germ cell apoptosis in adult mice[J].J Androl，1997，18（2）：159-65