張 峰，薛素萍，曲銀娥＊

（1.河北大學(xué)衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河北 保定071000；2.河北聯(lián)合大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院）

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMs）是指內(nèi)膜組織出現(xiàn)在子宮體以外的部位，一般僅見于生育年齡婦女；子宮腺肌?。ˋdenomyosis，Ad）是指子宮內(nèi)膜腺體和基質(zhì)侵入子宮肌層，多發(fā)生于40歲以上的經(jīng)產(chǎn)婦。EMs和Ad均為雌激素依賴性疾病，臨床上?？刹⒋妫l(fā)病機(jī)制及組織學(xué)發(fā)生不盡相同［1］。細(xì)胞色素P45017c羥化酶／17、20裂解酶由CYP17基因編碼，是雌激素代謝的關(guān)鍵酶，在一定程度上決定體內(nèi)雌激素水平。CYP17基因5＇非編碼區(qū)翻譯起始點(diǎn)－34bp處T－C單核苷酸多態(tài)與前列腺癌［2］和子宮內(nèi)膜癌［3］等疾病遺傳易感性有關(guān)，與內(nèi)異癥的關(guān)系目前尚存在爭(zhēng)議［4，5］。本文應(yīng)用PCR－RFLP技術(shù)，檢測(cè)了內(nèi)異癥、腺肌病和健康女性CYP17基因－34bp處T－C單核苷酸多態(tài)，旨在探討CYP17基因單核苷酸多態(tài)與內(nèi)異癥和腺肌病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2007年3月－2009年2月保定市第三醫(yī)院剖腹或腹腔鏡手術(shù)的61例子宮內(nèi)膜異位癥患者（內(nèi)異癥組）和59例子宮腺肌病患者（腺肌病組），所有病例均經(jīng)病理確診；選擇同期在此院體檢的健康女性65例為對(duì)照組。3組年齡分別為29.47±2.3歲、32.15±1.9歲、30.9±3.2歲，組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。所有研究對(duì)象無血緣關(guān)系，月經(jīng)周期規(guī)律，無其他內(nèi)外科及內(nèi)分泌疾病，排除家族性遺傳疾病如糖尿病、高血壓等疾病，術(shù)前三個(gè)月無服用激素類藥物及免疫抑制類藥物。

1.2 主要試劑和儀器

限制性內(nèi)切酶MspA1I、dNTP和TaqDNA聚合酶為美國(guó)Promega公司產(chǎn)品，PCR擴(kuò)增試劑盒購自加拿大Sangon公司，CYP17引物由北京賽百盛公司合成，凝膠電泳成像系統(tǒng)為FUJI FILM公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 基因組DNA提取 清晨空腹采集5ml靜脈血，檸檬酸鈉抗凝，蛋白酶K消化－苯酚法提取外周血基因組DNA，－70℃保存。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)Genebank查詢的基因序列，用Primer 5軟件，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，由北京賽百盛公司合成。

上游：5′－CATTCGCACTCTGGAGTC－3′

下游：5′－AGGCTCTTGGGGTACTTG－3′

片段大小為419bp

1.3.3 PCR擴(kuò)增體系及程序 25μl反應(yīng)體系：10×PCR buffer 2.5μl、去離子水17.3μl、上下游引物各5μl（20μM）、dNTPs 2μl、Taq聚合酶0.2μl（5U／μl）、模板 DNA 2μl（20ng／μl）。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，57℃退火1 min，72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)，末次循環(huán)后，72℃延伸5min，4℃保存。

1.3.4 酶切鑒定基因型 PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶MspA1I于37℃酶切過夜，20μl酶切體系：10×NE buffer 2μl、雙蒸水12.3μl、PCR產(chǎn)物5μl、100×BSA 0.2μl、MspA1I0.5μl（10U／μl）。取10μl酶切產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，確定基因型。隨機(jī)選擇CYP17 3種基因型PCR產(chǎn)物，送北京賽百盛公司測(cè)序驗(yàn)證基因型。等位基因頻率＝（2×純合子數(shù)＋雜合子數(shù)）／（2×受檢人群）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，基因型和等位基因頻率采用基因直接計(jì)數(shù)法計(jì)算，χ2檢驗(yàn)比較各組間基因型及等位基因頻率差異，非條件Logistic回歸計(jì)算比值比（OR）及95%可信區(qū)間（CI），確定基因型與內(nèi)異癥和腺肌病發(fā)生的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度。

2 結(jié)果

2.1 CYP17基因MspA1I酶切后基因型檢測(cè)結(jié)果

PCR產(chǎn)物及酶切產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結(jié)果，可見CYP17基因擴(kuò)增片段為419bp；CYP17基因－34bp處的T－C堿基置換后，產(chǎn)生一個(gè)能被內(nèi)切酶MspA1I識(shí)別的位點(diǎn)，因此PCR產(chǎn)物經(jīng)MspA1I酶切后，可產(chǎn)生3種基因型：野生純和型（A1A1）無 MspA1I酶切位點(diǎn)，僅有419bp 1個(gè)片段；突變純和型（A2A2）含有1個(gè)酶切位點(diǎn)，被切割為295bp、124bp 2個(gè)片段；雜合型（A1A2）被切割為419bp、295bp和124bp 3個(gè)片段（圖1）。隨機(jī)選擇CYP17 3種基因型PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，顯示堿基改變與酶切結(jié)果相吻合。

圖1 CYP17基因型圖譜

2.2 CYP17基因單核苷酸多態(tài)與內(nèi)異癥和腺肌病的關(guān)系

內(nèi)異癥組和腺肌病組A1A1基因型頻率及A1等位基因頻率均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；內(nèi)異癥組與腺肌病組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1、表2）。3組基因頻率分布均符合 Hardy－Weinberg遺傳平衡定律。

表1 3組CYP17基因型頻率比較（例數(shù)）

表2 3組CYP17等位基因頻率比較 （%）

2.3 CYP17各基因型的相對(duì)危險(xiǎn)度分析

非條件Logistic回歸結(jié)果表明：A1A1和A1A2基因型的個(gè)體發(fā)生內(nèi)異癥的相對(duì)危險(xiǎn)度（OR）分別是A2A2型個(gè)體的4.615倍和3.467倍，發(fā)生腺肌病的相對(duì)危險(xiǎn)度分別是A2A2型個(gè)體的3.692倍和3.867倍，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示A1A1、A1A2基因型可能增加內(nèi)異癥和腺肌病發(fā)生的危險(xiǎn)性，CYP17基因T－C單核苷酸多態(tài)與內(nèi)異癥和腺肌病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)（表3）。

表3 CYP17 3種基因型相對(duì)危險(xiǎn)度分析

3 討論

細(xì)胞色素P450c17α羥化酶／17、20裂解酶是雌激素合成代謝的關(guān)鍵酶之一，也是雌激素合成過程中的限速酶，介導(dǎo)類固醇17α羥化酶和17、20裂解酶活性，參與膽固醇前體向雄激素、雌激素或孕激素以及鹽皮質(zhì)激素或糖皮質(zhì)激素的轉(zhuǎn)化，由CYP17基因編碼。CYP17基因5′非編碼區(qū)翻譯起始點(diǎn)－34bp處有1個(gè)T－C單核苷酸突變，由于T－C的替換產(chǎn)生了限制性內(nèi)切酶MspA1I的酶切位點(diǎn)，產(chǎn)生Al和A2兩種等位基因，當(dāng)?shù)任换駻2存在時(shí)，理論上可以增加基因的轉(zhuǎn)錄效率，提高酶的活性，促進(jìn)雄激素合成增多［6］。

研究中發(fā)現(xiàn)，A1A1、A1A2和A2A2基因型頻率及A1等位基因頻率在腺肌病組和內(nèi)異癥組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示腺肌病和內(nèi)異癥在CYP17基因T－C單核苷酸多態(tài)方面具有相似的發(fā)病機(jī)制；危險(xiǎn)度分析顯示A1A1和A1A2基因型個(gè)體發(fā)生內(nèi)異癥的相對(duì)危險(xiǎn)度分別是A2A2型個(gè)體的4.615倍和3.467倍，發(fā)生腺肌病的相對(duì)危險(xiǎn)度分別是A2A2型個(gè)體的3.692倍和3.867倍，表明A1等位基因?yàn)閮?nèi)異癥的高危險(xiǎn)因素，A1A1和A1A2基因型為內(nèi)異癥和腺肌病的易感基因型。Hsieh等［4］發(fā)現(xiàn)CYP17基因的A1純合子等位基因增加內(nèi)異癥的危險(xiǎn)性，李維麟等［7］發(fā)現(xiàn)攜帶A1等位基因的婦女患內(nèi)異癥的風(fēng)險(xiǎn)可能更高，與我們的結(jié)論一致。Aban等［8－10］和 Garmer等［11］分別在對(duì)子宮內(nèi)膜癌和卵巢癌的研究中得到相似結(jié)論，而王曉莉［12］等發(fā)現(xiàn)CYP17基因啟動(dòng)子區(qū)T－C多態(tài)與成都地區(qū)子宮肌瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無相關(guān)性。CYP17基因多態(tài)性增加內(nèi)異癥易感性的機(jī)制目前仍不清楚，推測(cè)可能由于CYP17基因5′端啟動(dòng)子－34bp處的T－C點(diǎn)突變上調(diào)了CYP17基因表達(dá)，進(jìn)而造成雄激素合成增多；同時(shí)，可能A1等位基因結(jié)合、代謝循環(huán)中的雌激素能力較低［13］，因此，A1A1和 A1A2基因型個(gè)體雌激素水平較高，發(fā)生內(nèi)異癥和腺肌病的危險(xiǎn)增加，與臨床上絕經(jīng)后內(nèi)異癥和腺肌病病灶逐漸萎縮一致。

由于CYP17基因多態(tài)性具有明顯的地域和種族差異，且所選擇的內(nèi)異癥和腺肌癥患者的臨床分期、月經(jīng)周期等不同，加之基因間的相互作用，不同的研究可能得出不同的結(jié)論，尚需在不同人群中擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。

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