張秀梅，李洪利，聶慶東，祁瑞環(huán)，武天石

（清華大學(xué)醫(yī)院 檢驗科，北京100084）

同型半胱氨酸（Hcy）作為心腦血管疾病獨立危險因素分析指標(biāo)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床，Hcy水平預(yù)報心血管疾病的能力是膽固醇指標(biāo)的40倍，Hcy水平的微小增加就使心腦血管危險度大大增加，Hcy水平每增加5μmol／mL，心臟病危險增加240%，Hcy每增加一個標(biāo)準(zhǔn)差，患靜止性腦梗塞機率就增加24%。有研究報道，糖尿病人，血漿Hcy水平每升高5μmol／ml，未來5年內(nèi)死亡率增加3倍；Hcy每增加1μmol／L血栓危險性就增加4%，心血管疾病危險性增加3%［1］。因此了解Hcy在不同保存條件的穩(wěn)定性，確保Hcy檢測的準(zhǔn)確性，對正確判斷病人病情尤為重要。但目前關(guān)于其穩(wěn)定性極其操作的標(biāo)準(zhǔn)化問題一直沒有明確解決，我國Hcy檢測的樣本準(zhǔn)備等標(biāo)準(zhǔn)化操作程序尚未出臺，檢測樣本到底使用血清還是血漿，及Hcy在其中是否能穩(wěn)定存在還有待進一步研究。了解血清及血漿Hcy的濃度差異，及其在不同時間的變化是目前需要明確解決的問題。由于全血中紅細胞的甲基化進程對Hcy的穩(wěn)定性影響很大［2］，因此選擇EDTA－K2抗凝血分離血漿和血清進行研究，報告如下。

1 材料和方法

1.1 真空采血管 EDTA－K2抗凝真空采血管、血清分離膠真空采血管使用奧地利VACUETTE產(chǎn)品，由北京健峰公司提供。

1.2 樣本收集及處理 本院健康體檢人員42名，年齡35～60歲，男22名，女20名。分別抽取EDTA－K2抗凝管2ml及無抗凝劑分離膠管4ml各2管，EDTA－K2抗凝管取血后反復(fù)混勻8次，取血后立即離心分離血漿，室溫3 000轉(zhuǎn)離心10min，分離膠管取血后半小時待血液凝固后分離血清進行檢測；另兩管血液分別于室溫放置3h離心分離血漿和血清于1h內(nèi)測定Hcy濃度，觀察血漿與血清濃度差異及全血放置時間對Hcy濃度的影響。另分別取血漿與血清中的20份樣本于3h、6h及2－8℃24h后放室溫平衡30min后進行檢測Hcy濃度與分離后1h內(nèi)檢測濃度比較，觀察血漿與血清Hcy的穩(wěn)定性。

1.3 方法學(xué) 采用直接化學(xué)發(fā)光發(fā)法，使用德國西門子公司ADVIA Centaur XP化學(xué)發(fā)光分析儀及配套試劑及校準(zhǔn)質(zhì)控品，由北京若華公司提供。

1.4 統(tǒng)計分析 采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計分析，不同離心分離血清或血漿時間、離心后血漿或血清放置時間檢測結(jié)果以±s表示，數(shù)據(jù)采用配對資料t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血漿Hcy水平 取血后即刻離心檢測血漿濃度為9.14±2.89；取血后室溫放置3h離心檢測血漿濃度為10.28±3.45。兩者比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝－9.163，P＜0.05），放置3h離心檢測血漿中濃度較即刻離心檢測增加12.47%。結(jié)果見表1。

2.2 血清Hcy水平 取血后放置30min待血液凝固后離心檢測血清濃度為10.35±3.23；取血后室溫放置3h離心檢測血清濃度為11.65±3.7。放置3h離心檢測比取血后放置30min測之血清中濃度增加12.56%，兩者之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t＝－17.890，P＜0.05），結(jié)果見表1。

2.3 血漿與血清Hcy的比較 無論是取血后即刻離心，還是室溫放置3h離心分離，血漿和血清Hcy濃度之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，取血后即刻（30min）離心分離血清高于血漿13.24%（t＝－22.945，P＜0.05（以1小時分離血漿檢測之濃度計算），室溫放置3h分離血清濃度高于血漿13.33%（t＝－9.454，P＜0.05），結(jié)果見表1。

表1 即刻離心與放置3h離心分離血漿與血清Hcy濃度的比較（差異分析）（n＝42，μmol／ml）

2.4 分離血漿與血清后放置時間對Hcy影響 離心后在室溫分別放置1h、3h、6h，及2－8℃放置24h分別檢測Hcy濃度，與1h相比，即刻（30min）離心血清濃度在室溫3h、6h分別增加2.5%（t＝－2.257，P＞0.05）、3.45%（t＝－2.656，P＞0.05），2－8℃24h減低－1.25% （t＝2.623，P＞0.05），放置3h離心分別增加1.01%（t＝－2.973，P＞0.05）、2.53% （t＝－4.172，P＞0.05）、－1.43%（t＝3.687，P＞0.05）；血漿濃度即刻離心分別增加1.52%（t＝－1.047，P＞0.05）、2.3%（t＝－1.256，P＞0.05）、－0.4%（t＝0.847，P＞0.05），室溫放置3h離心檢測分別增加1.35%（t＝－1.467，P＞0.05），3.19%（t＝－3.578，P＞0.05），－0.87%（t＝0.916，P＞0.05），Hcy濃度在室溫放置呈時間依賴性增加，2－8℃放置24h濃度減低，但離心分離后血清或血漿在室溫6h內(nèi)及2－8℃24h內(nèi)檢測結(jié)果均無統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)果見表2－5。

表2 即刻離心分離血漿與血清Hcy濃度的比較（穩(wěn)定性分析）（n＝20，μmol／ml）

表3 放置3h離心分離血漿與血清Hcy濃度的比較（穩(wěn)定性分析）（n＝20，μmol／ml）

表4 即刻分離與放置3h分離血漿Hcy濃度的比較（穩(wěn)定性分析）（n＝20，μmol／ml）

表5 取血30min離心后與放置3h分離血清Hcy濃度的比較（穩(wěn)定性分析）（n＝20，μmol／ml）

3 討論

人體內(nèi)同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）的水平可以更準(zhǔn)確的預(yù)測患心臟病或中風(fēng)發(fā)生，而且可以更好的預(yù)測患老年癡呆癥的危險，高Hcy還可以幫助預(yù)報多種疾病風(fēng)險，包括冠狀動脈粥樣硬化、新生兒缺陷、習(xí)慣性流產(chǎn)、早衰、抑郁癥等。

結(jié)果顯示，分離膠管取血放置30min后離心分離血清Hcy濃度較即刻分離的血漿Hcy濃度高13.24%，結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。若取血后3h分離血清或血漿，其Hcy濃度都比取血后即刻分離血清或血漿檢測濃度有較明顯增加，分別增加12.47%和12.56%，結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。由此可見，Hcy檢測的標(biāo)準(zhǔn)化及設(shè)定不同條件的參考區(qū)間尤為重要。Hcy濃度與1h相比，即刻（30min）離心血清濃度在室溫3h、6h分別增加2.5%、3.45%，2－8℃24h減低－1.25% ，放置3h離心分別增加1.01%、2.53%、－1.43%；血漿濃度即刻離心分別增加1.52%、2.3%、－0.4% ，室溫放置3h離心檢測分別增加1.35%，3.19%，－0.87%，Hcy濃度在室溫放置呈時間依賴性增加，2－8℃放置24h濃度減低，但離心分離后血清或血漿在室溫6h內(nèi)及2－8℃24h內(nèi)檢測結(jié)果均無統(tǒng)計學(xué)意義。

有報道［3］全血樣本在3h內(nèi)如不能盡快離心分離，應(yīng)置于0－4℃碎冰上保存，以阻止紅細胞的甲基化過程。NCCLS提出關(guān)于Hcy檢測血液樣本處理及保存的建議是［9］：相同病人的血漿和血清樣品不能互換使用，使用血清檢測，應(yīng)在血液離心之前使樣品充分凝結(jié)；始終保持樣本蓋好并直立，樣品只能冷藏一次；應(yīng)盡快分離血清或血漿；不能盡快分離的應(yīng)儲存在冰上直至離心分離；禁止在室溫下儲存樣品；在2－8℃冷藏蓋好蓋子。何俊等［10］報道EDTA－NaF和EDTA－3DA管采集全血，置于室溫保存，可使血漿Hcy濃度至少穩(wěn)定3h，能夠較好地解決臨床工作中由Hcy穩(wěn)定性帶來的問題。

在實際工作中，使用EDTA－K2抗凝血漿時，由于一些其他全血檢測項目（如血常規(guī)、糖化血紅蛋白等）有相同抗凝樣本要求的，為減少樣本采集量等各種因素，常常共用一管EDTA－K2抗凝血，因此取血后檢測血常規(guī)、糖化血紅蛋白約3h分離血漿可能是常規(guī)工作條件，此時應(yīng)使用室溫放置3h分離血漿Hcy濃度參考區(qū)間：比即刻分離血漿參考區(qū)間高12.47%左右；因各方面原因如使用血清為檢測樣本，應(yīng)待血液凝固后盡快離心分離檢測，并使用血清樣本的參考區(qū)間分析檢測結(jié)果。如實際工作不能保證取血后即刻離心分離，保證在3h內(nèi)分離檢測，應(yīng)使用室溫放置3h分離血清的Hcy濃度參考區(qū)間，比即刻分離血清參考區(qū)間高13%左右。離心分離后的血清或血漿Hcy在室溫放置3h、6h及2－8℃放置24h，雖有濃度遞增，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義?？傊琀cy的檢測應(yīng)依據(jù)各實驗室檢測條件，建立相應(yīng)條件的檢測參考區(qū)間。

［1］王清濤，秦曉光.同型半胱氨酸的檢測和臨床應(yīng)用［J］.中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2006，29（3）：1935.

［2］Yadavl AS.Bhagwat VR.Pre－Analytical Errors in Blood Homocysteine Assays［J］.Al Ameen J Med Sci，2009，2：78.

［3］Refsum H，Smith AD，Ueland PM，et al.Facts and recommendations about total homocysteine determinations：an expert opinion［J］.Clin Chem，2004，50：3.

［4］National committee for Clinical Laboratory Standards.Procedures for handling and processing of blood specimens；second edition；approved guideline［S］.NCCLS Document H18－A2； Wayne（PA）：NCCLS，40.

［5］何 俊，班艷娜，張曉清，等.血漿同型半胱氨酸及其相關(guān)硫醇物在全血中的穩(wěn)定性研究［J］.中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2011，34（7）：598.