韓 冬，徐 煌，鄭永霞，肖燕萍

（嘉興學院醫(yī)學院，浙江 嘉興314001）

ADSCs（adipose－derived stem cells，脂肪間充質干細胞），是一類存在于脂肪基質中，具有自我更新能力和多分化潛能的成體干細胞。ADSCs取材方便，是細胞治療的良好種子細胞來源［1］。klotho是一種抗衰老基因，其基因缺陷型動物出現(xiàn)多種過早衰老的癥狀，如壽命縮短、骨質疏松、皮膚肌肉萎縮、聽力下降、軟組織鈣化等［2，3］。研究發(fā)現(xiàn)，klotho可以影響細胞的增殖，因此本研究將klotho基因轉染至ADSCs中觀察其對ADSCs增殖能力的影響，為深入研究klotho基因功能及ADSCs作為種子細胞進行細胞治療提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑 DMEM細胞培養(yǎng)液購自美國GIBCO公司，碘化丙碇（PI）購自美國sigma公司，Cell Counting Kit－8（CCK－8）購自日本同仁化學研究所，兔抗人cyclinD1抗體，HRP標記的羊抗兔二抗購自北京中杉公司。轉染試劑lipofectamine2000購自美國invitrogen公司，其他化學試劑為國產分析純，質粒 pcDNA3.1－GFP、pcDNA3.1－GFP－KL 由吉林圣元科技有限公司惠贈。

1.2 ADSC的分離 取脂肪吸脂術的脂肪抽提物50mg，用PBS溶液反復沖洗3次，然后依次加入5 ml的0.5%胰酶和0.1%膠原酶，置37℃細胞培養(yǎng)箱內消化15min，1 000rpm離心10min后去上清，PBS沖洗3次后，低速離心，棄掉漂浮的脂肪及脂滴，200目紗網過濾，收集細胞，將分離的單細胞移入培養(yǎng)皿中，10%FBS的DMEM、37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.3 Klotho基因的細胞轉染 將質粒pcDNA3.1－GFP和pcDNA3.1－GFP－KL （含有klotho全長基因序列）通過轉染試劑lipofectamine2000分別轉染至ADSC中，具體操作按說明書進行。在轉染后24 h、48h、96h采用 CCK－8法測定細胞增殖。將pcDNA3.1－GFP轉染組、pcDNA3.1－GFP－KL轉染組和未轉染組的ADSC細胞懸液分別調整至濃度為2.5×105／ml接種于96孔板，每孔加200μl調整好濃度的細胞懸液，37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)，每孔加入CCK－8溶液10μl，繼續(xù)培養(yǎng)2h，酶標儀上檢測各孔450nm處的OD值，以650nm波長為參考波長進行雙波長測定，以未轉染組為對照組，以pcDNA3.1－GFP轉染組、pcDNA3.1－GFP－KL轉染組為實驗組，按照公式：細胞增殖率＝實驗組（A）／對照組（A）×100% 計算細胞增殖率，比較各組間增殖率的差異。

1.4 Western blot法檢測細胞周期蛋白cyclin D1的表達 取第96h平行培養(yǎng)的未轉染組和pcDNA3.1－GFP轉染組、pcDNA3.1－GFP－KL轉染組的細胞，胰酶消化，含血清的培養(yǎng)基終止胰酶的作用，收集細胞于離心管中，細胞計數后4 000rpm離心5min，預冷PBS洗3次，棄上清，加入細胞裂解液150μl冰上孵育10min，14 000rpm離心10 min，收集上清。采用BCA蛋白定量法測定各組總蛋白濃度，取等量總蛋白在分離膠濃度為12%的條件下進行SDS－PAGE電泳，電泳結束后常規(guī)轉膜，依次用兔抗人cyclin D1的一抗和羊抗兔酶標二抗孵育，以β－actin為對照，檢測pcDNA3.1－GFP轉染組、pcDNA3.1－GFP－KL 轉染組和未轉染組cyclin D1的表達。

1.5 流式細胞儀測定ADSC的細胞周期 分別收集未轉染組和pcDNA3.1－GFP轉染組、pcDNA3.1－GFP－KL轉染組的細胞1×106個于離心管中，1 000rpm離心5min，棄上清加入1ml 70%預冷的乙醇4℃過夜。1 000rpm離心5min，棄上清，用PBS離心洗滌2次，加入1ml DNA抽提緩沖液（192ml 0.2mol／L Na2HPO4與8ml 0.1mol／L枸櫞酸的混合溶液），混勻室溫放置5min，1 000 rpm離心5min棄上清，將細胞重懸于濃度為100 mg／L的PI溶液中，室溫避光染色30min后流式細胞儀檢測。

2 結果

2.1 鏡下觀察分離和質粒轉染的ADSC形態(tài) 光鏡下觀察可見分離培養(yǎng)的ADSC呈貼壁生長，細胞形態(tài)為梭形，原代培養(yǎng)的細胞24h內即貼壁生長，轉染pcDNA3.1－GFP和pcDNA3.1－GFP－KL質粒的ADSC在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)綠色熒光，證明質粒已成功轉染入ADSC中，見圖1。

圖1 分離及轉染后ADSC的細胞形態(tài)

2.2 CCK－8法測定細胞增殖 測定吸光度值后計算各組增殖率，pcDNA3.1－GFP－KL組與未轉染組相比ADSC的增殖率在第24h、48h、96h分別為124.75%、140.52%、175.50%。而 pcDNA3.1－GFP組與未轉染組相比的增殖率在第24h、48h、96h分別為100.99%、101.29%、100.22%，細胞增殖率與對照組相比無明顯差異，各組吸光度結果見表1，細胞形態(tài)見圖2。

2.3 cyclinD1蛋白的表達western blot結果顯示pcDNA3.1－GFP－KL轉染組與 pcDNA3.1－GFP轉染組和未轉染組相比cyclin D1蛋白的表達水平明顯增高，結果見圖3。而轉染pcDNA3.1－GFP組和未轉染組相比cyclinD1蛋白的表達水平無明顯差異，而3組細胞的β－actin蛋白的表達無明顯差異。

表1 各組細胞不同時間的吸光度值

圖2 未轉染組及轉染組96hADSC的細胞形態(tài)

圖3 western blot檢測各組細胞cyclinD1的表達

2.4 流式細胞儀檢測細胞周期 未轉染組、pcDNA3.1－GFP－KL轉染組和pcDNA3.1－GFP轉染組的細胞周期分析結果顯示，pcDNA3.1－GFP－KL轉染組G0／G1期的細胞明顯減少（P＜0.05），而S期細胞明顯增多（P＜0.05），G2／M 期細胞也增多（P＜0.05），而未轉染組和pcDNA3.1－GFP轉染組的細胞周期分析無明顯差異，結果見表2。

表2 流式細胞儀測定各組細胞的細胞周期

3 討論

人klotho基因位于17號染色體的大臂，全長5.2kb，由5個外顯子和4個內含子組成［4］。Klotho是一種抗衰老基因，研究發(fā)現(xiàn)klotho基因發(fā)生突變可導致動物出現(xiàn)過早衰老癥狀及壽命縮短，而過表達klotho基因的小鼠則出現(xiàn)衰老抑制和壽命延長［5］。Klotho基因通過雙向作用發(fā)揮抗衰老的作用，體現(xiàn)為一方面抑制腫瘤細胞增殖，另一方面促進正常細胞增殖。已有研究證實Klotho基因可抑制IGF－1信號通路進而抑制腫瘤細胞增殖，而klotho基因也可抑制過量的維生素D引起的細胞凋亡，激活細胞的有絲分裂來發(fā)揮其促進正常細胞增殖作用［6，7］。klotho隨著年齡的增長和某些疾病條件下其表達呈下降趨勢。在自發(fā)性高血壓大鼠和糖尿病大鼠中持續(xù)的高壓和氧化應激使klotho表達明顯下降，在人慢性腎臟疾病中klotho表達也呈下降趨勢［8－10］，因此采用klotho基因轉染的手段，可以提高klotho在細胞的表達量，進而達到促進細胞增殖及抗衰老的目標。

ADSCs（adipose－derived stem cells，脂肪間充質干細胞），是一類存在于脂肪基質中，具有自我更新能力和多分化潛能的成體干細胞，研究證實它可分化為脂肪細胞、心肌細胞、成骨細胞、神經細胞等多種成體細胞。ADSCs可從吸脂術中的廢棄脂肪中分離，取材極為方便，ADSC認為是替代骨髓間充質干細胞用于細胞移植的理想種子細胞。ADSC在體外培養(yǎng)時，血清濃度、細胞密度等培養(yǎng)條件對其增殖能力影響較大。在既往研究中，我們發(fā)現(xiàn)ADSC增殖周期為1w左右，如能提高ADSC的體外增殖能力，在體外大量擴增ADSC，將為ADSC作為種子細胞進行細胞移植、構建工程化組織提供實驗基礎。

本研究中使用細胞轉染手段，將Klotho基因轉染至培養(yǎng)的ADSC中，通過CCK－8檢測細胞增殖能力，實驗結果為在轉染后96hpcDNA3.1－GFP－KL轉染組的增殖能力為未轉染組的175.50%，而通過流式細胞儀檢測細胞周期發(fā)現(xiàn)，轉染klotho基因后ADSC在靜止期（G0／G1期）細胞數明顯減少，而合成期 （S期）和有絲分裂期 （G2／M期）的細胞數明顯增多，說明ADSC轉染klotho基因后細胞的增殖能力明顯增強，而通過免疫組化的測定結果發(fā)現(xiàn)，ADSC中cyclinD1蛋白的表達在轉染klotho基因后明顯增高，而cyclinD1蛋白也是使細胞進入合成期，促進細胞增殖的必要條件，以上實驗結果均說明轉染klotho基因可增強體外培養(yǎng)ADSC的增殖能力。

Klotho作為抗衰老基因，其研究尚處于起步階段，其發(fā)揮抗衰老促進正常細胞增殖的分子機制有待深入研究。本研究采用轉染klotho基因的方法提高了ADSC體外增殖能力，為進一步研究klotho基因抗衰老的機制和將ADSCs用于細胞移植治療疾病打下實驗基礎。

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