周 亮，冷慧敏，2，翟慶娜，2，王 勇，孫 亮，李賢新，余振東，桂耀庭

（1.北京大學(xué)深圳醫(yī)院 男性生殖與遺傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳518036；2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院）

腎癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制尚未完全清楚，探索腎癌的致病基因?qū)τ诹私饽I癌的發(fā)病機(jī)制有重要的意義。microRNAs（miRNAs）是普遍存在的、調(diào)節(jié)基因表達(dá)的短非編碼（約22nt）小分子調(diào)節(jié)RNAs，是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的70－90個(gè)堿基的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成。1993年，miRNAs在秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegants）中首次被發(fā)現(xiàn)［1］，人類基因組中編碼超過1000個(gè)miRNAs。其功能是調(diào)節(jié)特異性mRNA靶標(biāo)活性，每一個(gè)miRNA可以抑制數(shù)百個(gè)mRNAs，在生理和病理過程中大范圍內(nèi)發(fā)揮重要作用［2］。目前的研究證實(shí)約一半的miRNAs其上游基因位于染色體中與腫瘤相關(guān)的區(qū)域內(nèi)，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與miRNAs之間存在著錯(cuò)綜復(fù)雜的聯(lián)系［3］。

本實(shí)驗(yàn)室前期應(yīng)用第二代大規(guī)模平行測序技術(shù)對10例腎透明細(xì)胞癌及其癌旁組織的microRNAs進(jìn)行全基因組測序后發(fā)現(xiàn)：miR－210表達(dá)差異顯著，與其癌旁組織相比較平均上調(diào)約26倍。本研究應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)比較miR－210在52例不同階段的腎細(xì)胞癌及其癌旁組織中表達(dá)量的差異［4］，用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析miR－210表達(dá)量的差異與腎癌病理分期、年齡及性別的關(guān)系，以求發(fā)現(xiàn)新的診斷指標(biāo)和新的治療腎癌的方法。

1 對象與方法

1.1 對象 收集北京大學(xué)深圳醫(yī)院、深圳市人民醫(yī)院、中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院泌尿外科等未經(jīng)治療的原發(fā)性腎細(xì)胞癌患者手術(shù)切除的癌及其相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本52例。所有標(biāo)本均有完整的臨床病理資料，HE染色判定組織學(xué)類型，所有癌組織的相應(yīng)癌旁組織為正常腎實(shí)質(zhì)結(jié)構(gòu)，無腫瘤細(xì)胞。所有病例均按照WHO分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷，病理分型和分期按照美國癌癥聯(lián)合會(huì)（AJCC）的TNM 分期進(jìn)行［5］。腎癌臨床病理資料見表1。

每例標(biāo)本留取3份組織：一份經(jīng)4%甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋；一份立即置于4℃RNA Later（Ambion）中，24h后置于－80℃保存待用；一份放于液氮。

表1 52例腎癌患者臨床病理資料

1.2 方法

1.2.1 前期測序及生物信息學(xué)分析 本研究組前期通過第二代大規(guī)模平行測序技術(shù)檢測腎癌組織與遠(yuǎn)端癌旁組織差異表達(dá)的miRNAs和mRNA，發(fā)現(xiàn)表達(dá)上調(diào)和下調(diào)的miRNAs，其中miR－210在癌組織中顯著上調(diào)。

1.2.2 總RNA提取與逆轉(zhuǎn)錄 用Trizol法分別提取52例腎癌及其相應(yīng)癌旁組織的總RNA。無RNA酶的DNA酶I處理，紫外分光光度計(jì)和1.5%的瓊脂糖凝膠檢測示質(zhì)量好，無降解。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas公司）說明書，取1μg總RNA，用BIO－RAD（UV－2450）的PCR儀上進(jìn)行。

1.2.3 熒光實(shí)時(shí)定量PCR（Realtime PCR）檢測腎癌及相應(yīng)癌旁組織中miR－210的表達(dá)量 采用miRNAs定 量 RT－PCR 檢 測 試 劑 盒 （miScript SYBR Green PCR Kit試劑盒，Qiagen，Germany生產(chǎn)分別檢測52對腎癌及其癌旁組織中miR－210的表達(dá)量。上游引物由Invitrogen公司合成：5－CT－GTGCGTGTGACAGCGGCTGA－3；下游引物是由miScript SYBR Green PCR Kit試劑盒提供的通用引物（詳見試劑盒說明書），反應(yīng)在PRISM 7000實(shí)時(shí)定量PCR儀（Ambion）上完成。先將1μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為第1鏈cDNA，以第1鏈cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為：PCR Mix 10μl，引物0.8μl（0.2μmol／L），cDNA 1μl，ROX 0.4μl，ddH2O7.8μl；50℃ 2min，95℃ 2min，95℃ 15s，55℃20s，72℃30s，40個(gè)循環(huán)。U6snRNA作為內(nèi)參照進(jìn)行歸一化。miR－210在腎癌組織中的表達(dá)量的計(jì)算公式為：2－△CT，其中△CT＝CTmi－210－CTU6［6］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS10.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。對2－△CT的計(jì)算結(jié)果取對數(shù)［log2（x）］，得到的結(jié)果用－△CT表示。應(yīng)用配對t檢驗(yàn)對－△CT的結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±sx）表示，以比較腎癌和相應(yīng)癌旁組織中miR－210表達(dá)水平的差異。應(yīng)用卡方檢驗(yàn)分析其差異與腎癌病理分期、年齡、性別的關(guān)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR－210在腎細(xì)胞癌及相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)差異

2.1.1 總結(jié)分析前期數(shù)據(jù) 總結(jié)分析實(shí)驗(yàn)室前期通過miRNA測序技術(shù)對10例腎透明細(xì)胞癌及其癌旁組織miRNAs測序的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)miR－210在癌組織中的表達(dá)較癌旁組織表達(dá)上調(diào)約26倍。

2.1.2 RNA抽提和質(zhì)控 組織總RNA用TRIZOL法抽提，提取后于1.5%瓊脂糖凝膠上樣電泳，紫外照膠儀下觀察，結(jié)果顯示5s，18s，28s條帶清晰，28s的亮度較18s高。同時(shí)紫外分光光度計(jì)檢測示 A260／A280值介于1.80－2.10之間，A260／A230值均大于2.00。

2.1.3 熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測miR－210在癌及相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)差異 應(yīng)用實(shí)時(shí)定量RT－PCR檢測52對不同階段新鮮腎癌及相應(yīng)癌旁組織中miR－210的表達(dá)量，見圖1。miR－210表達(dá)量的計(jì)算公式為：2－△CT，其 中 △CT＝ CTmi－210－CTU6［6］。 對2－△CT的計(jì)算結(jié)果取對數(shù) ［log2（x）］，得到的結(jié)果－△CT符合正態(tài)分布。經(jīng)SPSS10.0分析得出miR－210在腎癌組織的平均表達(dá)量為－5.788 4±5.085 0，癌旁組織的平均表達(dá)量為－7.476 1±4.591 4。miR－210在腎細(xì)胞癌與癌旁組織中的表達(dá)差異顯著（P＝0.00），見圖2。

圖1 腎癌及相應(yīng)癌旁組織mir－210表達(dá)的熒光定量PCR結(jié)果電泳圖

圖2 miR－210在52例腎癌組織及相應(yīng)癌旁組織中－△CT值的分布情況

2.1.4 熒光實(shí)時(shí)定量PCR產(chǎn)物測序結(jié)果 取miR－210在腎癌及其相應(yīng)癌旁組織熒光定量PCR的產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測序，測序結(jié)果與之前第二代大規(guī)模平行測序技術(shù)所得的序列一致，表明PCR擴(kuò)增產(chǎn)物正確。

2.2 miR－210表達(dá)量與腎癌病理分型、分期、年齡及性別的相關(guān)性

miR－210以腎癌組織miR－210表達(dá)量的平均值－5.7884為界，將52例病例分為miR－210低表達(dá)組和miR－210高表達(dá)組［7］。再分別按照年齡（中位年齡48歲）分為≤48歲組和＞48歲組；按照性別分為男性和女性組以及按照 TNM 分期分為 T1－2N0M0組和T3－4N0M0 ＆ TXNXMX組。研究結(jié)果顯示：癌組織miR－210表達(dá)的高低與患者的年齡沒有相關(guān)性（0.30＜P）；癌組織 miR－210表達(dá)的高低與患者的性別沒有相關(guān)性（0.70＜P）；癌組織miR－210表達(dá)的高低與癌組織的TNM分期沒有相關(guān)性（0.50＜P），結(jié)果見表2。

3 討論

腎癌是一種高致死性泌尿生殖道腫瘤，是泌尿系統(tǒng)第二大腫瘤，且發(fā)病率每年增長2.5%。雖然，近年來腎細(xì)胞癌在影像學(xué)、外科治療和基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域取得一定進(jìn)展，但對于早期轉(zhuǎn)移的腎細(xì)胞癌患者而言，常規(guī)治療的應(yīng)答率低（不超過25%）并伴有嚴(yán)重副作用。

表2 miR－210表達(dá)量與腎癌病理分期的關(guān)系

目前，miRNAs的表達(dá)和功能是腫瘤研究的熱點(diǎn)問題。有研究認(rèn)為，遺傳或表觀遺傳的改變和與miRNA加工相關(guān)的基因及其蛋白的異常變化是miRNA表達(dá)異常的原因。主要的遺傳改變是染色體異常，超過50%的miRNA位于脆性位點(diǎn)，并且常常與癌癥相關(guān)［8］。Kort等研究認(rèn)為腎母細(xì)胞瘤組織中miR－17－92簇過表達(dá)與轉(zhuǎn)錄因子E2F3活性增加有關(guān)。腎癌中低表達(dá)的let－7f是let－7家族成員，let－7在腫瘤中低表達(dá)是由于與其前體綁定的Lin－28和Lin－28BRNA結(jié)合蛋白抑制了let－7前體加工過程，導(dǎo)致其不能被加工為成熟的let－7，且負(fù)性調(diào)控RAS基因［9］。腎癌中高表達(dá)的miR－378通過抑制融合同源物抑制因子（sufs）與融合因子1（Fus－1）兩種腫瘤抑制基因的表達(dá)促進(jìn)腫瘤的生長和血管的發(fā)生［10］。高表達(dá)的miR－421使N－Myc轉(zhuǎn)錄因子過表達(dá)促進(jìn)腫瘤形成［11］。

VHL參與的低氧通路與腎細(xì)胞癌發(fā)生密切相關(guān)，有研究表明miR－210在缺氧細(xì)胞中表達(dá)顯著上調(diào)，對細(xì)胞生存至關(guān)重要［12］。2009年黃等人的研究發(fā)現(xiàn)miR－210表達(dá)依賴于HIF（缺氧誘導(dǎo)因子）－1α，此外，缺氧條件可以誘導(dǎo)miR－210在胰腺癌，乳腺癌，頭頸部腫瘤，肺癌，結(jié)腸癌和腎細(xì)胞癌細(xì)胞株中的表達(dá)，表明miR－210在啟動(dòng)腫瘤發(fā)生過程中的重要作用［13］。最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)缺氧條件可以誘導(dǎo)腎細(xì)胞癌細(xì)株系7860表達(dá)miR－210，表明HIF－2α也可以調(diào)節(jié)的miR－210的表達(dá)［14］。以上研究意味著，HIF－1α可能是miR－210的最重要最直接的上游調(diào)控因子，可是當(dāng) HIF－1α缺乏時(shí)，HIF－2α也可以介導(dǎo)的miR－210的表達(dá)。通過靶基因3＇UTR熒光素酶檢測實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證證實(shí)miR－210的靶基因?yàn)镠OXA1，HOXA9和FGFRL1［15］。

本研究組前期利用miRNAs測序技術(shù)對10例腎癌及其癌旁組織提取的miRNAs進(jìn)行測序并檢測其表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)miR－210在腎癌中的表達(dá)上調(diào)最為顯著。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR對52例不同階段的腎細(xì)胞癌及其癌旁組織進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)miR－210在癌組織中較相應(yīng)癌旁組織中表達(dá)平均上調(diào)了7倍，由此證明miR－210對腎癌的發(fā)生和發(fā)展有著重要的作用。但進(jìn)一步對表達(dá)量和臨床信息的分析顯示：miR－210的表達(dá)量與腎癌的病理分期、病人的年齡和性別并無顯著相關(guān)，這樣的結(jié)果可能與病例數(shù)目較少有關(guān)。本研究表明miR－210在腎癌發(fā)生過程中可能起到癌基因的作用，為腎癌的后續(xù)研究打下了良好的基礎(chǔ)。

［1］Lee R，F(xiàn)einbaum R，Ambors V.The C.elegans heterochronic gene lin－4encodes small RNAs with antisense complementarity to lin－14［J］.Cell，1993，75（5）：843.

［2］Kloosterman W P，Plasterk R H.The diverse functions of microRNAs in animal development and disease［J］.Dev Cell，2006，11（4）：441.

［3］曾四平，肖亞平，章小平，等.MicoRNAs及其在泌尿系腫瘤的研究進(jìn)展［J］.臨床合理用藥雜志，2009，2（12）：4.

［4］Zhou L，Chen J，Li Z，et al.Integrated profiling of microRNAs and mRNAs：microRNAs located on Xq27.3associate with clear cell renal cell carcinoma［J］.PLoS One，2010，5（12）：e15224.

［5］Singletary SE，Allred C，Ashley P，et al.Staging system for breast cancer：revisions for the 6th edition of the AJCC Cancer Staging Manual［J］.Surg Clin North Am，2003，83（4）：803.

［6］Livak KJ，Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real－time quantitative PCR and the 2（－Delta Delta C（T））method［J］.Methods，2001，25（4）：402.

［7］顏黎栩，黃馬燕，吳秋良，邵建永，等.miR－21的表達(dá)異常與乳腺癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系［J］.中國病理生理雜志，2009，5（4）：76.

［8］Calin GA，Sevignani C，Dumitru CD，et a1.Human microRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2004，101（9）：2999.

［9］Johnson SM，Grosshans H，Shingara J，et al.RAS is regulated by the let－7microRNA family［J］.Cell，2005，120（5）：635.

［10］Lee DY，Deng Z，Wang CH，et al.MicroRNA－378promotes cell survival，tumor growth，and angiogenesis by targeting SuFu and Fns－l expression［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2007，104（51）：20350.

［11］Hu H，Du L，Nagabayashi G，et al.ATM is down－regulated by N－Myc－regulated microRNA－421［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2010，107（4）：1506.

［12］Fasanaro P，D＇Alessandra Y，Di Stefano V，et al.MicroRNA－210 modulates endothelial cell response to hypoxia and inhibits the receptor tyrosine kinase ligand Ephrin－A3［J］.J Biol Chem，2008，283（23）：15878.

［13］Huang X，Ding L，Bennewith KL，et al.Hypoxia－inducible mir－210regulates normoxic gene expression involved in tumor initiation［J］.Mol Cell，2009，35（6）：856.

［14］Zhang Z，Sun H，Dai H，et al.MicroRNA miR－210modulates cellular response to hypoxia through the MYC antagonist MNT［J］.Cell Cycle，2009，8（17）：2756.

［15］Lijoy K，Mathew M，Celeste Simon.mir－210：a sensor for hypoxic stress during tumorigenesis［J］.Mol Cell，2009，35（6）：737.