韓 永，徐燕杰，黃海燕，許曉光，蔡 明，石炳毅

（解放軍第309醫(yī)院全軍器官移植中心研究室，北京100091）

膀胱移行上皮細(xì)胞癌（transitional cell carcinoma of bladder，TCCB）是泌尿外科最常見的惡性腫瘤，早期治療愈后佳，5年生存率可達(dá)80%，晚期治療療效差，5年生存率僅50%［1］。膀胱鏡檢查及細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測是最常用的診斷TCCB的方法，但細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測敏感性低，膀胱鏡檢查因痛苦患者難以接受［1］。檢測尿液中與膀胱癌發(fā)生相關(guān)的抗原診斷TCCB敏感性較低，易漏診。應(yīng)用尿脫落細(xì)胞熒光原位雜交技術(shù)（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）檢測3、7、9、17號(hào)染色體數(shù)目畸變診斷TCCB敏感度高、特異性強(qiáng)，且無創(chuàng)性，尤其對早期TCCB患者有輔助診斷作用，對TCCB的診斷具有重要價(jià)值［2－3］。

基質(zhì)金屬基質(zhì)蛋白酶（matrix metallo－proteinases，MMPs）是人體內(nèi)降解細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular marix，ECM）的主要酶類，而ECM 在腫瘤的侵襲和浸潤過程中發(fā)揮重要的作用。MMP－9是MMPs家族中的重要成員之一，與多種腫瘤的惡性生物學(xué)表現(xiàn)以及預(yù)后密切相關(guān)［4，5］。本研究通過對100例TCCB患者及20例健康體檢者采用EL ISA法檢測血清MMP－9含量，同時(shí)聯(lián)合熒光原位雜交技術(shù)檢測尿脫落細(xì)胞，探討二項(xiàng)聯(lián)合檢測診TCCB癌的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2007年1月－2008年4月在解放軍總醫(yī)院第二附屬醫(yī)院器官移植中心泌尿外科住院TCCB患者100例（膀胱癌組），診斷均經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)。男81例，女19例；年齡20－60歲，中位年齡52歲。腫瘤臨床病理分級：T1－T2 47例，T3－T4 53例。對照組20例，男15例，女15例；年齡20－60歲，2組性別、年齡比較差異有無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 MMP－9檢測 應(yīng)用ELISA法，試劑盒購自美國ROCHE公司，按說明書進(jìn)行操作。TCCB組于手術(shù)前檢測。

1.2.2 FISH 采用多中心，雙盲研究比較FISH和尿細(xì)胞學(xué)檢查診斷肉眼和鏡下血尿患者患TCCB的敏感性。血尿經(jīng)過證實(shí)后，尿液標(biāo)本被送往中心單位實(shí)驗(yàn)室，患者行膀胱鏡檢，膀胱鏡下的可疑病變均取活檢或者切除，病理標(biāo)本診斷并分期分級（圖1，圖2）。熒光原位雜交（FISH），探針標(biāo)記P16，3、7、17號(hào)染色體著絲粒試劑盒均購自北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司產(chǎn)品，－20℃保存?zhèn)溆谩?、17號(hào)染色體著絲粒探針為綠色熒光信號(hào)，7號(hào)染色體著絲粒探針和雜交到9號(hào)染色體長臂（9q21）的P16探針為桔紅色熒光信號(hào)。

收集受檢者新鮮尿液后分為2份，1份按照試劑盒說明書方法進(jìn)行FISH實(shí)驗(yàn)操作，另1份離心涂片（離心半徑10cm，離心時(shí)間10分鐘，2 500r／min），HE染色尋找腫瘤細(xì)胞。

間期FISH步驟：取出儲(chǔ)存于－20℃的離心涂片標(biāo)本，具體步驟參照試劑說明書，具體見文獻(xiàn)［9］；

通過FISH點(diǎn)計(jì)數(shù)分析2.0軟件控制的冷電荷耦合設(shè)備相機(jī)攝取圖像，OLYMPUS BX51熒光顯微鏡，每組探針分析100－200個(gè)細(xì)胞。

1.3 結(jié)果判定 單體：單個(gè)信號(hào)的核比例＞15%；3倍體及多倍體：3個(gè)及多個(gè)信號(hào)的核比例＞10%細(xì)胞總數(shù)。組合探針（P16，3、7，17）陽性判定依據(jù)UroVysion推薦標(biāo)準(zhǔn)［7］：至少在4個(gè)細(xì)胞中同時(shí)存在3、7、17號(hào)染色體中的2個(gè)染色體的擴(kuò)增，或至少在12個(gè)細(xì)胞中存在9p21純合性缺失。尿脫落細(xì)胞學(xué)以發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞為陽性，未發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組血清MMP－9水平比較 TCCB組與正常組比較，血清中 MMP－9水平明顯升高（P＜0.001），相關(guān)性分析結(jié)果，年齡、性別、腫瘤類型因素與TCCB MMP－9陽性表達(dá)無明顯相關(guān)（P＞0.05）。

2.2 2組FISH脫落細(xì)胞學(xué)檢測結(jié)果比較 采集20個(gè)健康成人尿液，使用推薦方法制備玻片及進(jìn)行CSP7／CSP3P16／CSP17的FISH檢測。閾值測定每組探針組合分析200個(gè)細(xì)胞.統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)不同異常情況的百分比.閾值＝ 平均數(shù)（M ）＋3x標(biāo)準(zhǔn)差（SD）。如果檢測值大于閾值，判定為陽性結(jié)果。FISH檢測出現(xiàn)2個(gè)紅色信號(hào)的間期細(xì)胞為98.5%，3個(gè)紅色信號(hào)的間期細(xì)胞數(shù)為（0.94±1.2）%。健康成人FISH結(jié)果顯示各探針表現(xiàn)為2紅、2綠2個(gè)雜交信號(hào)（圖3）。在TCCB組，F(xiàn)ISH結(jié)果可見不同程度的染色體數(shù)目異常（見圖4）。對照組FISH及尿脫落細(xì)胞學(xué)檢測結(jié)果均為陰性。TCCB組FISH檢測全部為陽性（見圖4）。TCCBFISH陽性表達(dá)相關(guān)性分析，年齡，性別，腫瘤類型因素與膀胱癌FISH陽性表達(dá)無明顯相關(guān)（P＞0.05）。參數(shù)病理分級越高，F(xiàn)ISH 陽性突變越高，表明TCCBFISH陽性表達(dá)呈現(xiàn)規(guī)律性量化改變，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

2.3 不同病理學(xué)分級 膀胱癌患者血清中MMP－9水平比較隨著腫瘤組織學(xué)分級增高，膀胱移行細(xì)胞癌血清中MMP－9含量依次升高，具有顯著性差異（P＜0.001），見表1。

表1 對照組與不同組織學(xué)分級膀胱移行細(xì)胞癌血清MMP－9含量比較

2.4 相關(guān)分析結(jié)果 TCCB組血清MMP－9表達(dá) 與年齡，性別，腫瘤類型因素?zé)o明顯相關(guān)（P＞0.01）。TCCB FISH陽性表達(dá)的相關(guān)性分析：年齡，性別，腫瘤類型因素與膀胱尿路上皮癌FISH陽性表達(dá)無明顯相關(guān)（P＞0.05）。病理分級越高，F(xiàn)ISH陽性突變越高，說明TCCB患者FISH陽性表達(dá)呈現(xiàn)出規(guī)律性的量化改變，差異顯著（P＜0.01）（表2）。

3 討論

目前，膀胱鏡組織活檢病理檢查為診斷膀胱癌金標(biāo)準(zhǔn)，尿脫落細(xì)胞學(xué)、經(jīng)腹部超聲檢查、尿核基質(zhì)蛋白－2（NMP－2）、膀胱腫瘤抗原（BTA）及免疫細(xì)胞因子（ImmunoCyt）等腫瘤標(biāo)記物是發(fā)現(xiàn)和檢測TCCB的常用方法［6－8］。但膀胱鏡為有創(chuàng)檢查，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致出血、膀胱穿孔等并發(fā)癥，患者不易接受，尤其對泌尿系統(tǒng)急性感染期、尿道狹窄、膀胱容量過小、出血性疾病、女性月經(jīng)期及不能接受膀胱截石體位的患者無法行膀胱鏡檢查。膀胱鏡視野也有一定盲區(qū)。尿脫落細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查方法簡單、無創(chuàng)，是診斷和術(shù)后隨訪的主要方法。但敏感性相對較低。

圖1 尿路上皮癌Ⅲ級HE（100倍）

圖2 尿路上皮癌Ⅲ級HE（400倍）

圖3 正常人F ISH陰性

圖4 尿路上皮癌FISH陽性

表2 研究組膀胱移行細(xì)胞癌FISH陽性表達(dá)的相關(guān)性分析

隨著對TCCB遺傳學(xué)改變的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)9號(hào)染色體部分（如p16位點(diǎn)）或全部丟失是最常見遺傳學(xué)改變，且這一改變與TCCB的早期發(fā)生密切相關(guān)。此外，TCCB的發(fā)展與染色體不穩(wěn)定性也緊密相連，尤其是與3，7號(hào)及17號(hào)染色體的非整倍性密切相關(guān)［1］。對尿液或膀胱沖洗液中細(xì)胞進(jìn)行以上遺傳學(xué)改變的檢測對TCCB的早期診斷及病程監(jiān)測有較大價(jià)值，其靈敏度高于細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測，特異性則與細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測相當(dāng)。Halling等［9］對265例患者在TCCB檢查前檢測上述指標(biāo)，診斷TCCB的敏感性為81%，特異性為100%。Skacel等［10］報(bào)道，對尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查不確定或非典型性改變的標(biāo)本再行檢測，敏感性可達(dá)100%，特異性達(dá)89%。因此，對于細(xì)胞學(xué)檢查不確定的病例，可作為一項(xiàng)檢測手段。而Yoder等［11］研究結(jié)果認(rèn)為，對于尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查診斷模糊或不典型的病例，檢測可以明確TCCB的診斷，無需行膀胱鏡檢查。本研究結(jié)果顯示，隨著腫瘤級別的增高，F(xiàn)ISH靈敏度也隨之升高。

有研究結(jié)果證實(shí)［9－11］，使用尿脫落細(xì)胞熒光原位雜交技術(shù)檢測3、7、9、17號(hào)染色體數(shù)目畸變診斷膀胱移行細(xì)胞癌具有敏感度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，并具無創(chuàng)性，尤其對早期尿路上皮癌患者有輔助診斷作用，對TCCB的診斷具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。目前FISH技術(shù)復(fù)雜還不夠成熟，檢測費(fèi)用亦較高，時(shí)間周期長（3－4天），臨床中還未大量開展開展腫瘤的FISH檢測。

侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要特征，是腫瘤細(xì)胞、宿主細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）之間一系列復(fù)雜、多步驟相互作用的結(jié)果，其中腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間相互作用在這一過程中起著關(guān)鍵作用，而MMPs幾乎降解ECM的所有成分，從而促進(jìn)癌細(xì)胞對周圍正常組織的侵襲，導(dǎo)致腫瘤的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移［11］。已有研究結(jié)果［12，13］發(fā)現(xiàn)，血清中 MMPs及其他細(xì)胞因子水平可夠反映組織中的表達(dá)情況，通過測定血清中的水平，評價(jià)其在腫瘤生長中的作用。本研究通過對血清MMPs水平的測定也證實(shí)了上述結(jié)果。膀胱移形細(xì)胞癌組血清MMP－9水平明顯高于正常對照組。此外發(fā)現(xiàn)隨著腫瘤臨床分期的增高，浸潤性膀胱移行細(xì)胞癌患者血清中的 MMP－9濃度明顯高于淺表性膀胱腫瘤，分析其可能與浸潤性膀胱腫瘤更易膀胱異位復(fù)發(fā)有關(guān)。本研究還對不同組織學(xué)分級的膀胱移形細(xì)胞癌患者血清中的MMPs進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)上述指標(biāo)隨腫瘤病理學(xué)分級的增加而增高。國外研究表明在測定肺癌［14］、乳腺癌［15］患者血清 MMPs含量時(shí)，發(fā)現(xiàn)隨著腫瘤分期及級別升高，濃度明顯升高，與本研究結(jié)果一致。腫瘤組織中均存在MMPs的高表達(dá)，由于組織中MMPs的高表達(dá)，明膠酶MMPs通過降解毛細(xì)血管和淋巴管基底膜，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)入循環(huán)中，腫瘤細(xì)胞再分泌 MMPs，引起遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［16－19］。血清中 MMPs高含量可能與膀胱腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移及高復(fù)發(fā)率有關(guān)，并提示預(yù)后不良。綜上所述，MMPs參與了膀胱腫瘤的早期發(fā)生、發(fā)展，并與腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移有關(guān)，MMPs的血清學(xué)檢測，直接反映血清中的濃度，其含量的測定可作為判斷膀胱移形細(xì)胞癌預(yù)后的重要指標(biāo)之一。

熒光原位雜交，基質(zhì)金屬基質(zhì)蛋白酶水平聯(lián)合檢測對膀胱癌的診斷有重要參考價(jià)值，彌補(bǔ)了單獨(dú)檢測熒光原位雜交的不足。腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測的最大意義在于增加腫瘤檢出的線索，為臨床診斷、早期治療提供了重要的參考價(jià)值，并可能作為判斷膀胱移形細(xì)胞癌預(yù)后的重要指標(biāo)。

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