劉浩宇，吳廣智，崔樹森

（吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 手外科，吉林 長春130033）

胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal－regulated kinase，ERK）是信號網(wǎng)絡(luò)中絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族的一員，ERK1／2的活化具有抑制細胞凋亡、促進創(chuàng)傷愈合及神經(jīng)再生的作用［1］。丙戊酸鈉（sodium valproate，VPA）是目前臨床上應(yīng)用較廣的抗癲癇藥物，近年來研究［2，3］發(fā)現(xiàn)大鼠腦組織損傷后VPA對其具有保護神經(jīng)元、降低炎性反應(yīng)、促進神經(jīng)再生等作用。但是，關(guān)于VPA的作用機制卻不清楚。因此，作者通過建立大鼠坐骨神經(jīng)損傷模型，應(yīng)用VPA進行干預(yù)，檢測損傷相關(guān)的脊髓運動神經(jīng)元胞體中p－ERK1／2的表達情況，繼而探討VPA對大鼠坐骨神經(jīng)損傷后脊髓運動神經(jīng)元保護作用的機制。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 健康雄性Wister大鼠64只，體重250－300g（吉林大學(xué)動物實驗室），隨機分為：對照組：即單純坐骨神經(jīng)切斷組，實驗組：即：丙戊酸鈉組，每組32只。各組按手術(shù)后1、3、7、14d分為4個時間點，每個時間點8只。主要試劑：一抗：p－ERK1／2－1（Promega公司），β－actin（Sigma公司），VPA片（江蘇省恒瑞制藥有限公司）。使用濃度及方法嚴格按照說明書配制。

1.2 給藥方法 術(shù)后當天給藥。丙戊酸鈉組給VPA片，將藥片取出研成粉末后用生理鹽水稀釋成50ml／L混懸液灌胃，每1ml懸液含生藥0.05g，按大鼠每250g體重1.5ml給藥，每日給藥1次，相當于生藥300mg／（kg.d），作為實驗組；單純坐骨神經(jīng)切斷組坐骨神經(jīng)原位縫合后給予生理鹽水，按每100g體重1ml灌胃，每日1次，作為對照組。

1.3 模型制備與取材 3%戊巴比妥鈉40mg／kg腹腔麻醉大鼠，術(shù)區(qū)常規(guī)消毒，做右側(cè)臀部斜行切口，鈍性分離肌肉，暴露坐骨神經(jīng)，將坐骨神經(jīng)完全切斷，在12倍手術(shù)顯微鏡下將其神經(jīng)兩端正確對位后，用9－0無損傷線吻合斷端4針，逐層閉合創(chuàng)口。

1.4 免疫組化法 石蠟切片脫蠟后室溫孵育，5%－10%正常山羊血清（PBS稀釋）封閉，室溫孵育、去血清，滴加適當比例稀釋的一抗p－Erk1／2兔抗鼠單克隆抗體（1：100），4℃孵育過夜。DAB顯色、沖洗、復(fù)染、封片。結(jié)果判定：陽性為細胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。①不著色為陰性（細胞著色比例＜10%），②染色呈淡黃色為弱陽性（＋）（10%＜細胞著色比例＜25%），③黃色為陽性（＋＋）（25%＜細胞著色比例＜50%），④棕黃色為強陽性（＋＋＋）（50%＜細胞著色比例）。

1.5 Western blot 快速將液氮中的組織取出，研碎、裂解細胞，分離提取蛋白，測定濃度，每個泳道15ug，進行8%SDS－PAGE電泳。轉(zhuǎn)至PDVF膜，一抗p－ERK1／2抗體（1：2500），4℃搖床輕搖孵育過夜，二抗Goat Anti Rabbit IgG，F(xiàn)ITC偶聯(lián)抗體（1：5000）室溫搖床輕搖2小時。按ECL顯色試劑盒說明書操作顯色，X光膠片曝光，然后進行條帶掃描和分析P－ERK1／2表達。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 將Western blot條帶掃描和分析，各組計量數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS 10.0版軟件進行統(tǒng)計分析，組間比較采用t檢驗分析，P＜0.05為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠坐骨神經(jīng)切斷后，VPA對脊髓運動神經(jīng)元p－ERK1／2表達的定位分析 400倍鏡下觀察：對照組：1d時，運動神經(jīng)元胞質(zhì)中p－Erk1／2表達呈強陽性（＋＋＋），胞核中未見表達（圖1－1）。3d時，胞質(zhì)仍呈強陽性表達（＋＋＋），胞核中未見表達（圖1－3）。7d時，胞質(zhì)內(nèi)呈黃色為陽性表達（＋＋）（圖1－5）。14d時，逐漸衰減呈淡染，為弱陽性表達（圖1－7）。實驗組：1d時，運動神經(jīng)元胞質(zhì)中p－Erk1／2表達呈強陽性（＋＋＋），胞核中未見表達（圖1－2）；3d時，胞質(zhì)仍呈強陽性表達（＋＋＋），胞核中未見表達（圖1－4）；7d時，胞質(zhì)內(nèi)呈黃色為陽性表達（＋＋），可見少量細胞核內(nèi)有表達（圖1－6）；14d時，逐漸衰減呈淡染，為弱陽性表達（圖1－8）。

2.2 大鼠坐骨神經(jīng)切斷后，VPA對脊髓運動神經(jīng)元p－ERK1／2表達的定量分析 Western blot結(jié)果顯示（圖2）：對照組：術(shù)后3d時，p－ERK1／2的表達達到高峰；術(shù)后7－14d，p－ERK1／2的表達逐漸下調(diào)。實驗組：術(shù)后3d時，p－ERK1／2的表達達到高峰；術(shù)后7－14d，p－ERK1／2的表達逐漸下調(diào)。組間數(shù)據(jù)分析顯示：術(shù)后1－7d，實驗組相關(guān)p－ERK1／2表達明顯高于對照組（P＜0.05）具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討論

ERK是信號網(wǎng)絡(luò)中絲裂原活化蛋白激酶家族的一員，坐骨神經(jīng)切斷后各種刺激的傳導(dǎo)可能引起相應(yīng)脊髓運動神經(jīng)元胞體一些信號分子的表達變化，通過各種細胞因子激活ERK通路促進細胞存活和抑制細胞凋亡［4］。正常狀態(tài)下，ERK位于胞漿中，當激活后轉(zhuǎn)位至胞核，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子活性，例如活化轉(zhuǎn)錄因子 AP－1、fas、jun，也參與BCL－2的磷酸化、活化CDK2、CDK4、活化NF－KB誘導(dǎo)生存基因表達，產(chǎn)生細胞效應(yīng)［5］。因此，研究坐骨神經(jīng)損傷后，VPA對大鼠脊髓運動神經(jīng)元p－ERK1／2的表達變化，對研究VPA對大鼠坐骨神經(jīng)損傷后脊髓運動神經(jīng)元保護作用機制具有重要意義。

圖1 脊髓運動神經(jīng)元p－ERK1／2免疫組化，＊400

圖2 脊髓運動神經(jīng)元p－ERK1／2定量分析（＊ 對照組比較P＜0.05）

VPA是一種經(jīng)典的抗癲癇藥物，臨床使用已有多年，由于其價格便宜，安全性好，受到廣大患者的歡迎，一些癲癇病人還長期服用。但是，關(guān)于VPA的作用機制卻不清楚。本實驗結(jié)果顯示：術(shù)后1－28d，VPA實驗組相關(guān)p－ERK1／2表達明顯高于對照組。這些研究結(jié)果表明：VPA對脊髓運動神經(jīng)元的保護作用可能是因為VPA激活了MAPK／ERK信號傳導(dǎo)途徑，該途徑是內(nèi)源性神經(jīng)生長因子［6］常用的信號傳遞系統(tǒng)，該途徑亦可調(diào)控的基因表達［7］，包括生長相關(guān)蛋白（GAP－43）和Bcl－2，促進神經(jīng)生長和細胞存活。

［1］Waetzig V，Herdegen T.The concerted signaling of ERK1／2and JNKs is essential for PC12cell neuritogenesis and converges at the level of target proteins［J］.Mol Cell Neurosci，2003，24（1）：238.

［2］Bosetti F，Bell JM，Manickam P.Microarray analys is of rat brain gene expression after chronic administration of sodium valproate［J］.Brain Res Bull，2005，65（4）：331.

［3］劉世清，吳 飛，饒 婷，等.丙戊酸對大鼠坐骨神經(jīng)修復(fù)與再生作用的影響［J］.中國臨床康復(fù)，2005，9（9）：26.

［4］Bonni A，Brunet A，West AE，et al.Cell survival promoted by the Ras MAPK signaling transcription－dependent and independent mechanisms［J］.Science，1999，286（5443）：1358.

［5］Michaela M，Jason EC，Josef A，et al.ERK－dependent and－independent pathways trigger human neural progenitor cell migration［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2007，221（1）：57.

［6］Husseini K，Manji，Gregory J，et al.Clinical and pre－clinical evidence for the neurotrophic effects of mood stabilizers：Implications for the pathophy siology and treatment of manic－depressive illness［J］.Biol Psychiatry，2000，48：740.

［7］Mora A，Gonzalez－Polo RA，F(xiàn)uentes JM，et al.Different mechanisms of protection against apoptosis by valproate and Li1［J］.Eur J Biochem，1999，266：886.