呂天羽，王 康，劉建軍，何建凡，李德萍，唐 敏，王玉新，戴 勇＊

（1.廈門市第二醫(yī)院，福建 廈門361021；2.深圳市人民醫(yī)院，暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 深圳518020；3.深圳市疾病預(yù)防控制中心，廣東 深圳518020；4.重慶醫(yī)科大學(xué)，重慶400016）

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物模型 雄性近交系lewis（RT11）大鼠6只，F(xiàn)344（RT11v1）大鼠6只，（均購自北京維通利華實驗動物有限公司）體重260－280g。隨機分組，F(xiàn)344大鼠為供體lewis大鼠為受體，獲得同種異基因移植模型［1］。術(shù)后不給予免疫抑制劑干預(yù)治療。術(shù)后3d動物仍存活則認(rèn)為大鼠腎移植急性排斥反應(yīng)動物模型建模成功。

1.1.2 標(biāo)本收集 術(shù)后3d、7d取出移植腎，每個時間點樣本為3只。標(biāo)本一部分行HE染色病理學(xué)檢查；另一部分液氮保存，待用。

1.1.3 試劑 固相pH梯度干膠條（pH4－7，13cm；pH3－11，13cm）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、TEMED、2Dclean－up kit、2DQuant Kit 購 于 Amersham Pharmacia Biotech公司；甲叉雙丙烯酰胺、丙烯酰胺、過硫酸胺、硝酸銀、碳酸鈉、甘油、甘氨酸購于BBI公司；丙酮購于Sigma公司；蛋白酶抑制劑（Complete Mini，EDTA－free）購于 Roche公司，其他試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.4 主要儀器 IPGphor等電聚焦儀、SHE600垂直電泳儀、高精度掃描儀、ImageMaster 2D5.0凝膠分析軟件為安瑪西亞公司（Amersham Pharmacia Biosciences）公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 溶液成分 樣品裂解液、IPG溶脹液、平衡液、銀染溶液均參照郭堯君［2］著《蛋白質(zhì)電泳實驗技術(shù)》配制。

1.2.2 腎臟雙向凝膠電泳 ①腎臟組織蛋白的制備取液氮中大鼠移植腎，室溫解凍，研磨成細(xì)粉末狀。按組織凈重：裂解液＝1∶10比例其中加入蛋白酶抑制劑混合制劑 Complete Mini，EDTA－free，1片／10ml。冰上繼續(xù)研磨。收集液體，4℃12 000×g 60分鐘后收集上清液。再經(jīng)以下處理（1）組織蛋白樣品純化（2）樣品蛋白濃度測定。所得樣品－80℃冰箱保存，備用。②雙向凝膠電泳 按IPGphor TM等電聚焦系統(tǒng)指南進(jìn)行雙向電泳。③染色 銀染色和考馬斯亮藍(lán)染色都是采用郭堯君［3］的染色方法并作適當(dāng)改動。

1.2.3 2DE圖像采集與分析

染色的凝膠經(jīng)透射掃描用ImageMaster2D5.0軟件分析，不同膠匹配點相對含量的比值＞2或者＜0.5認(rèn)為存在差異。

2 結(jié)果

2.1 病理學(xué)結(jié)果

大鼠腎移植后7d可以看到腎小動脈周淋巴細(xì)胞浸潤，結(jié)締組織增生，腎小動脈外膜結(jié)締組織增生，淋巴細(xì)胞浸潤。

2.2 雙向電泳凝膠結(jié)果

從四種不同角度對腎臟組織進(jìn)行蛋白質(zhì)圖譜分析，分析結(jié)果如表1。

表1 雙向凝膠電泳檢測結(jié)果

3 討論

腎移植急性排斥反應(yīng)是排斥反應(yīng)中最常見的一種類型。但是到目前為止，對于早期診斷腎移植急性排斥反應(yīng)的發(fā)生仍沒有可靠的依據(jù)。應(yīng)用新的研究技術(shù)進(jìn)一步探索其早期診斷的特征性標(biāo)記物，成為了各國研究人員關(guān)注的焦點。雙向電泳技術(shù)作為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的經(jīng)典方法，它當(dāng)然成為了現(xiàn)今研究的熱點。因此建立一個專門針對腎臟組織成分變化的方案才能更好地應(yīng)用蛋白質(zhì)組技術(shù)開展腎移植排斥反應(yīng)的研究。本研究以大鼠腎臟組織蛋白為樣品，對樣品制備、等電聚焦（IEF）上樣量、凝膠染色等進(jìn)行比較和條件的優(yōu)化，獲得滿意的大鼠腎臟組織蛋白2DE圖譜。

（1）本研究首先用13cm（pH3－11NL）的膠條進(jìn)行IEF，發(fā)現(xiàn)組織蛋白廣泛分布于等電點（PI）3－11的范圍。大鼠腎移植同種異基因移植物檢測到（626±49）個蛋白點，平均匹配率為65.76%；經(jīng)ImageMaster2D5.0凝膠軟件分析發(fā)現(xiàn)差異蛋白主要分布在PI4 5－7.0范圍處，為更清晰觀察和比較異基因移植物中差異性表達(dá)的蛋白分布情況，以下研究均采用13cm（pH4－7L）IPG膠條。

（2）組織樣品中的非蛋白雜質(zhì)如鹽、外源帶電小分子、去污劑等多種小分子，這些物質(zhì)會影響IEF，使電壓難以達(dá)到IEF所需，最終可能影響2DE的分離效果。本研究選用丙酮沉淀和2Dclean－upkit純化樣品，與處理前相比這兩種方法均能得到清晰的蛋白點。但丙酮處理會致血清PI5－6處蛋白丟失，影響該區(qū)域差異蛋白的比較，為確保差異表達(dá)的蛋白均能呈現(xiàn)出來本研究采用2Dclean－upkit來處理樣品。

（3）樣品蛋白含量測定的準(zhǔn)確性會直接影響IEF上樣量的確定和2DE圖譜蛋白點呈現(xiàn)的多少。如果異基因移植物樣品的蛋白上樣量太低，在2DE圖譜染色呈現(xiàn)的蛋白點也很少，從而影響異基因移植物中蛋白質(zhì)表達(dá)的比較。蛋白上樣量過大的話對蛋白點的分離效果就不好，較模糊。本研究采用的蛋白不同上樣量中，120μg蛋白能得到最佳的圖譜效果，有差異表達(dá)的蛋白點顯示較為清晰。但是這一上樣量不一定就是最合適的，在今后的實驗中仍需摸索。

（4）蛋白質(zhì)被分離后，能否被有效檢測，染色方法起到很重要的作用。2DE的染色方法有許多種?？捡R斯亮藍(lán)染色［4］雖特異性高，但是對上樣的劑量要求大，在相同上樣量的情況下，與經(jīng)改良的銀染方案［5］相比較，其敏感性較差。最終以銀染色法的電泳圖譜更為滿意。

通過對以上幾種有可能影響組織蛋白質(zhì)雙向電泳的各因素比較，本研究獲得了優(yōu)化后的大鼠異基因移植物蛋白質(zhì)圖譜衍變的研究方案，即：使用13 cmIPG膠條（pH4－7L）進(jìn)行等電聚焦、2Dclean－upkit純化蛋白樣品、改良的銀染色法方案，為條件優(yōu)化后的大鼠異基因移植物蛋白質(zhì)2DE銀染圖譜。在相同條件下，分別對不同時間點的樣品進(jìn)行3次雙向電泳實驗，掃描圖譜經(jīng)ImageMaster2D5.0凝膠軟件分析和數(shù)據(jù)統(tǒng)計后顯示：移植后3d異基因移植物中檢測到（512±62）個蛋白點，平均匹配率為76 32%；移植后7d異基因移植物中檢測到（478±56）個蛋白點，平均匹配率為73.11%，提示本項研究采用的蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)方案有較好重復(fù)性，為今后異基因移植物研究提供了一個新的實驗體系。

［1］王 康，戴 勇，李德萍，等.大鼠原位腎移植模型腎靜脈吻合方法的改良［J］.中華器官移植雜志，2006，27（1）：54.

［2］郭堯君.雙向電泳.見：郭堯君.蛋白質(zhì)電泳實驗技術(shù)［M］.第2版.北京：科學(xué)出版社，2005，203－207.

［3］郭堯君.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳.見：郭堯君.蛋白質(zhì)電泳實驗技術(shù)［M］.第2版.北京：科學(xué)出版社，2005：106－108.

［4］Candiano G，Bruschi M，Musante L，et al.Blue silver：A very sensitive colloidal Coomassie G－250staining for proteome analysis［J］.Electrophoresis 2004，25（9）：1327.

［5］王劍青，戴 勇，鄧國安，等.尿毒癥患者血清蛋白質(zhì)組份的雙向凝膠電泳－飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜分析研究［J］.中華腎臟病，2005，9（21），506.