孫國(guó)龍，王凱忠，周 莉，付 鑫，田曉巍，王登莉，趙 慧＊

（1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 胸外科，吉林 長(zhǎng)春130021；2.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，吉林 長(zhǎng)春130021）

樹(shù)突狀細(xì)胞（Dendritic Cell－DC）是由Steinman和Cohn［1］（1973）首次分離出來(lái)的，它是目前所知的機(jī)體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，也是唯一能將抗原提呈給初始T細(xì)胞，激發(fā)初次免疫應(yīng)答的抗原提呈細(xì)胞。本研究從小鼠骨髓及脾臟中獲取DC的前體細(xì)胞，然后在細(xì)胞因子的作用下培養(yǎng)出DC，并對(duì)其進(jìn)行鑒定以及比較這兩種不同組織來(lái)源細(xì)胞分化成DC的差異。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器 三洋CO2培養(yǎng)箱、BD Bioscience流式細(xì)胞儀、奧林巴斯光學(xué)倒置顯微鏡。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑 ICR小鼠18只，雄性，體重20－25g，周齡8－10w，無(wú)菌環(huán)境飼養(yǎng)。由吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心所提供。EZ－SepTMMouse淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自達(dá)科為生物技術(shù)有限公司，IL－4、GMCSF、FITC－labeled Anti－Mouse CD80、PE－labeled Anti－Mouse CD86購(gòu)自美國(guó)PEPROTECH公司。

1.3 細(xì)胞提取 ICR小鼠經(jīng)脫頸椎處死后立即浸入體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇中5－10min。無(wú)菌取出脾以及游離小鼠四肢帶有髓腔的骨骼。

脾臟的處理：去除脾臟外表面的脂肪被膜，以預(yù)冷至4℃pH 7.2的PBS沖洗2次，在35mm培養(yǎng)皿中放入4mL EZ－SepTMMouse淋巴細(xì)胞分離液。經(jīng)充分研磨后把懸有脾臟細(xì)胞的分離液立即轉(zhuǎn)移到15mL離心管中，覆蓋200μl的1640培養(yǎng)基。室溫，800g離心30min。細(xì)胞層由上到下分4層，1640覆蓋層、淋巴細(xì)胞層、EZ－Sep分離液層、紅細(xì)胞及其他細(xì)胞和死細(xì)胞碎片。吸出淋巴細(xì)胞層，再加入10mL1640培養(yǎng)基，顛倒洗滌。室溫，250g，離心10min收集細(xì)胞。傾倒上清液，用無(wú)血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞。將細(xì)胞濃度調(diào)至5×106／ml，然后分瓶培養(yǎng)。

股骨的處理：無(wú)菌手術(shù)取出股骨、脛骨、肱骨，盡量將其表面的肌肉和結(jié)締組織去除干凈，然后放入無(wú)菌的PBS中，剪斷骨的兩端，用1ml無(wú)菌注射器抽取含青霉素鈉6U／ml，鏈霉素10U／ml的生理鹽水反復(fù)沖洗出骨髓，直至骨變白，收入15mL離心管中，1 500r／min，5min離心，棄上清，收集沉淀的骨髓細(xì)胞，置于含有雙抗、10%胎牛血清、終濃度為2mmol／L的谷氨酰胺的RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。分裝于細(xì)胞培養(yǎng)瓶。置于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

脾臟的淋巴細(xì)胞和骨髓細(xì)胞都靜置培養(yǎng)48小時(shí)后，傾去懸浮細(xì)胞，更換新的培養(yǎng)液，同時(shí)加入GMCSF（終濃度500ng／L）和IL－4（終濃度200ng／L）。

1.4 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的觀察 在培養(yǎng)的第1、2、3、4、5、6、7天用光鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)變化，照相。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面的共刺激分子 收集的培養(yǎng)細(xì)胞用PBS懸浮為1×106細(xì)胞／ml，加入3個(gè)EP管中，300μl／管，在2個(gè)管里分別加入FITC－labeled Anti－Mouse CD80 和 PE－labeled Anti－Mouse CD86（終濃度為0.5mg／L），另1個(gè)EP管內(nèi)的培養(yǎng)細(xì)胞不加入熒光標(biāo)記抗體，將其作為空白對(duì)照組?；靹?，置于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中孵育45min。孵育結(jié)束后用PBS清洗2遍，1 500rpm離心3min，棄上清，各加300μL的PBS（pH＝7.4）懸浮，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。各組細(xì)胞3、5、7天行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，觀察CD80、CD86表達(dá)隨培養(yǎng)細(xì)胞成熟的變化趨勢(shì)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行Fisher精確概率法檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察 見(jiàn)圖1。

圖1 The expression of cytokines of the bone marrow cells cultured with stimulating factor GM－CSF and IL－4at different time points（n＝6）

由小鼠骨髓直接分離的DC很少，經(jīng)GM－CSF和IL－4誘導(dǎo)分化培養(yǎng)3天后DC量逐漸增多，細(xì)胞大量增殖，每2只小鼠的骨髓細(xì)胞可得到（2.0－5.0）×107個(gè)DC，完全能夠滿足實(shí)驗(yàn)的要求。

骨髓細(xì)胞鏡下觀察：培養(yǎng)的第1天在光學(xué)顯微鏡下觀察：培養(yǎng)液中充滿了大量的骨髓原始細(xì)胞，大小不等，懸浮細(xì)胞數(shù)較多；第2天部分細(xì)胞邊緣開(kāi)始出現(xiàn)少量不規(guī)則形態(tài)的突起，貼壁細(xì)胞數(shù)目增多；在第3天貼壁細(xì)胞數(shù)量明顯增加，部分細(xì)胞伸出很多像樹(shù)枝樣的突起，培養(yǎng)瓶中可見(jiàn)明顯細(xì)胞集落形成，細(xì)胞狀態(tài)長(zhǎng)勢(shì)良好；第4天細(xì)胞數(shù)目明顯增加，培養(yǎng)液中出現(xiàn)漂浮的或松散聚結(jié)的典型DC，部分形成較大的細(xì)胞集落；第5天少量細(xì)胞懸浮起來(lái)；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，第6天伸出突起的細(xì)胞出現(xiàn)突起回縮的狀態(tài)，大量細(xì)胞懸浮起來(lái)；第7天懸浮細(xì)胞大量增多，大量細(xì)胞出現(xiàn)衰老死亡現(xiàn)象。

脾臟淋巴細(xì)胞鏡下觀察：在培養(yǎng)的7天內(nèi)光學(xué)顯微鏡下觀察培養(yǎng)液中未見(jiàn)貼壁的細(xì)胞，大量細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)。

2.2 流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)結(jié)果 見(jiàn)圖2～圖4。

本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示：GM－CSF和IL－4誘導(dǎo)培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞在第3天均可檢測(cè)到CD80、CD86，但是表達(dá)的百分率低，CD86基本不表達(dá)。在誘導(dǎo)培養(yǎng)的第5天，CD80表達(dá)的百分率是第3天的12倍，但是CD86表達(dá)的百分率與第3天表達(dá)相比無(wú)明顯變化。誘導(dǎo)培養(yǎng)第7天CD80表達(dá)的百分率是第5天的3倍，但是CD86表達(dá)仍很低，與第3天、第5天相似，無(wú)明顯變化。結(jié)果表明，CD80表達(dá)的百分率隨著細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)率呈遞增趨勢(shì)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示各組間差異顯著，P＜0.01。而CD86表達(dá)的百分率一直呈低表達(dá)的現(xiàn)象。

3 討論

DC是目前為止發(fā)現(xiàn)的功能最強(qiáng)的專(zhuān)職抗原提呈細(xì)胞，它對(duì)誘導(dǎo)初次免疫應(yīng)答具有獨(dú)特的功能。盡管其在體內(nèi)數(shù)量甚少，但分布廣泛，遷徙力強(qiáng)，加之樹(shù)枝狀表面所賦與的巨大表面積，有利于接觸并提呈抗原，是提呈能力最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞。未成熟的DC具有很強(qiáng)的吞噬、加工處理抗原的能力，它作為免疫耐受原在移植免疫應(yīng)答中的重要地位。它是唯一能激活初始免疫應(yīng)答的抗原提呈細(xì)胞［2－4］。在接受抗原刺激成熟后，DC可以有效地?cái)z取抗原并通過(guò)抗原肽／MHC分子復(fù)合物的形式將抗原有效地提呈給初始T細(xì)胞，并刺激其生成針對(duì)該抗原的特異性的細(xì)胞毒性T細(xì)胞，從而有效地啟動(dòng)機(jī)體的免疫反應(yīng)［5］。

圖2 GM－CSF和IL－4誘導(dǎo)培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)第3天的細(xì)胞流式圖譜

圖3 GM－CSF和IL－4誘導(dǎo)培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)第5天的細(xì)胞流式圖譜

由于DC在體內(nèi)含量極低，而且提取物中又會(huì)含有其他的細(xì)胞，因此DC的體外培養(yǎng)關(guān)鍵問(wèn)題是DC的分離、提取以及誘導(dǎo)分化。本實(shí)驗(yàn)用ICR小鼠做DC的來(lái)源，但它骨髓細(xì)胞含量極其少，通過(guò)培養(yǎng)增加數(shù)量，滿足實(shí)驗(yàn)的要求。從股骨中提取骨髓細(xì)胞和脾臟中提取淋巴細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)的過(guò)程中，通過(guò)細(xì)胞的貼壁特性，盡量除去粒細(xì)胞，以提高培養(yǎng)DC的純度。同時(shí)應(yīng)加入刺激因子，使其向DC分化。在培養(yǎng)過(guò)程中，GM－CSF起到重要的作用，不僅誘導(dǎo)DC前體細(xì)胞增殖，而且還能促進(jìn)DC的分化和延長(zhǎng)DC的壽命，并使骨髓前體細(xì)胞形成集落，促進(jìn)DC的增殖，若是單獨(dú)使用GM－CSF只能產(chǎn)生少量的DC集落。IL－4能抑制培養(yǎng)體系中的中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的產(chǎn)生。GM－CSF與IL－4聯(lián)合應(yīng)用，既能提高DC的產(chǎn)量，又能增加DC的純度。通過(guò)脾臟淋巴細(xì)胞和骨髓細(xì)胞分化成DC的結(jié)果觀察：骨髓細(xì)胞的前體細(xì)胞誘導(dǎo)分化成DC的數(shù)量多，易獲得，誘導(dǎo)時(shí)間短。而脾臟淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)分化為DC，不僅難獲得，而且誘導(dǎo)周期長(zhǎng)，獲得的DC數(shù)量也極其有限，不利于后續(xù)試驗(yàn)的進(jìn)行。

圖4 GM－CSF和IL－4誘導(dǎo)培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞誘導(dǎo)第7天的細(xì)胞流式圖譜

本實(shí)驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)如下：1）剛提取出來(lái)的骨髓細(xì)胞，在加入刺激因子之前最好不要頻繁地移動(dòng)培養(yǎng)瓶，以便細(xì)胞能充分地貼壁，也防止貼壁的細(xì)胞懸浮起來(lái)，影響其貼壁的能力；2）選擇加入刺激因子的時(shí)間為提取細(xì)胞培養(yǎng)48小時(shí)后加入。原因就是細(xì)胞數(shù)量大部分已經(jīng)充分貼壁，可增加誘導(dǎo)成DC的數(shù)目。3）對(duì)于誘導(dǎo)中采用的細(xì)胞的因子濃度，不同的文獻(xiàn)報(bào)道差異較大，并且誘導(dǎo)時(shí)間，處理方法都不完全相同。在本實(shí)驗(yàn)中，我們采用終濃度為500 ng／L GM－CSF、200ng／L IL－4的細(xì)胞因子組合。誘導(dǎo)培養(yǎng)3d即可見(jiàn)到大量的具有典型樹(shù)突狀突起的細(xì)胞生成；4）脾臟來(lái)源的主要是淋巴細(xì)胞，脾臟的淋巴細(xì)胞數(shù)目雖多，但培養(yǎng)48小時(shí)后貼壁的細(xì)胞數(shù)目少，加刺激因子后細(xì)胞數(shù)目變化不大。培養(yǎng)7天后貼壁的細(xì)胞數(shù)目有所增加，由于誘導(dǎo)周期長(zhǎng)，不利于進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。與文獻(xiàn)報(bào)道的有很大的差異［6］。為了進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)只能采取骨髓來(lái)源來(lái)誘導(dǎo)DC；5）體外誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞培養(yǎng)3d即可見(jiàn)到大量的具有典型樹(shù)突狀突起的細(xì)胞生成。隨著時(shí)間的推移，細(xì)胞數(shù)目大量的增加，但是通過(guò)多次實(shí)驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)，在培養(yǎng)到第7天，細(xì)胞就開(kāi)始出現(xiàn)懸浮狀態(tài)，并且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，懸浮的細(xì)胞數(shù)目大量增加，大量細(xì)胞出現(xiàn)衰老死亡現(xiàn)象。不利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的實(shí)施。前7天的骨髓細(xì)胞處于未成熟期，如果加入LPS（磷酸脂多糖）則可誘導(dǎo)成為成熟的DC。根據(jù)細(xì)胞的狀態(tài)，培養(yǎng)到3－5d的細(xì)胞可利于后續(xù)試驗(yàn)的進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)的目的是獲得未成熟的DC。后續(xù)試驗(yàn)利用其具有強(qiáng)大的專(zhuān)職抗原提呈細(xì)胞的功能以及它對(duì)誘導(dǎo)初次免疫應(yīng)答獨(dú)特的功能，再與后續(xù)分選的CD4＋CD25＋Treg細(xì)胞結(jié)合對(duì)抗移植器官的排斥反應(yīng)。

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