錢(qián)寧，孫燦林，姜琳，趙國(guó)軍，蔣小芹，于鴻

(1.姜堰市人民醫(yī)院麻醉科，江蘇 姜堰225500;2.泰州市人民醫(yī)院麻醉科，江蘇泰州225300;3.泰州市人民醫(yī)院病理科，江蘇泰州225300)

嗎啡作為一種臨床常用的阿片類(lèi)藥物，廣泛應(yīng)用于終末期癌癥疼痛及各種中重度非癌癥疼痛治療，其鎮(zhèn)痛作用及機(jī)制已被深入研究。近年來(lái)的研究表明，嗎啡可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡并抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，但具體機(jī)制并不十分明了。本研究通過(guò)觀察不同濃度嗎啡對(duì)體外培養(yǎng)的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞生存素(survivin)和livin表達(dá)的影響，探討其促進(jìn)細(xì)胞凋亡及抑制細(xì)胞增殖的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所)，DMEM、胎牛血清、RT-PCR試劑盒(Gibco公司，美國(guó))，二甲基亞砜(DMSO)、四氮噻唑鹽(MTT)、Annexin V-FITC試劑盒(Sigma公司，美國(guó))，兔抗人survivin多克隆抗體、兔抗人livin多克隆抗體(Santa Cruz公司，美國(guó))，ABC試劑盒(Vector公司，美國(guó))，嗎啡(批號(hào):110120－2，東北制藥集團(tuán)公司沈陽(yáng)第一制藥廠)，PCR引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 μg/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素的 DMEM 培養(yǎng)液，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞重懸，以1×103個(gè)/ml接種在6孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h，采用隨機(jī)數(shù)字表法，將MCF-7細(xì)胞隨機(jī)分為3組:對(duì)照組，不作任何處理;0.1μmol/L嗎啡組，加入終濃度0.1 μmol/L 嗎啡;1.0 μmol/L 嗎啡組，加入終濃度1.0 μmol/L 嗎啡。每組18 孔。

1.3 RT-PCR法檢測(cè)生存素和livin mRNA表達(dá)

于嗎啡孵育24 h時(shí)，每組各取18孔細(xì)胞，用Trizol抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，等量cDNA依照本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法［1］進(jìn)行PCR。PCR引物序列:內(nèi)參照GAPDH上游5'-ACCACAGTCCATGCCATGCCATCAC-3';下游 5'-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為450 bp。生存素上游5'-GGACCACCGCATCTCTACAT-3';下游 5'-GCACTTTCTTCGCAGTTTCC-3'，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為338 bp。Survivin反應(yīng)條件:50℃逆轉(zhuǎn)錄30 min，95℃滅活逆轉(zhuǎn)錄酶15 min，94 ℃ 變性2 min，60 ℃ 復(fù)性1 min，72 ℃ 延伸 1 min，共35個(gè)循環(huán)。livin上游5'-GTCCCTGCCTCTGGGTAC-3';下游 5'-CAGGGAGCCCACTCTGCA-3'，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為368 bp。內(nèi)參照及l(fā)ivin反應(yīng)條件同上。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)生存素和livin蛋白表達(dá)

于嗎啡孵育24 h時(shí)，每組各取18孔細(xì)胞，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法［2］使用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白含量測(cè)定，依標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行8%SDS-PAGE變性電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜。PVDF膜用10%羊血清37℃封閉10 min。一抗為兔抗人survivin多克隆抗體(1∶100)，兔抗人livin多克隆抗體(1∶100)，二抗為生物素化山羊抗兔多克隆抗體(1∶500，ABC 試劑盒)。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖水平

分別于嗎啡孵育24，48及72 h時(shí)，每組各取18孔細(xì)胞，將各組細(xì)胞以1×103個(gè)/ml細(xì)胞數(shù)接種于96 孔板中，每孔加入 MTT(5 mg/ml)20 μl，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，每孔加入 150 μl DMSO，震蕩 10 min，置酶標(biāo)儀上檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處光密度(D)值。取18孔D值的平均值表示細(xì)胞增殖水平。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

于嗎啡孵育24 h時(shí)，每組各取6孔細(xì)胞，重懸細(xì)胞，離心后棄上清，取細(xì)胞沉淀，采用Annexin VFITC試劑盒進(jìn)行測(cè)定，以FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BD公司，美國(guó))分析，每孔重復(fù)測(cè)定3次，取平均值，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.7 定量和統(tǒng)計(jì)分析

凝膠電泳用凝膠成像儀進(jìn)行拍照記錄，Kodak Digital Science 1D掃描分析系統(tǒng)測(cè)定條帶的積分光密度(ID)。采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用成組t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 生存素mRNA和蛋白表達(dá)的改變

RT-PCR 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，0.1 μmol/L嗎啡組生存素 mRNA表達(dá)顯著降低(t=18.375，P ＜0.01)，1.0 μmol/L 嗎啡組生存素 mRNA 表達(dá)亦顯著降低(t=16.241，P ＜ 0.01)，0.1 μmol/L 嗎啡組與1.0 μmol/L嗎啡組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.946，P ＞0.05)，見(jiàn)圖 1。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示相對(duì)分子質(zhì)量16 500蛋白條帶(圖2)。與對(duì)照組相比，0.1 μmol/L 嗎啡組與 1.0 μmol/L 嗎啡組生存素蛋白表達(dá)均顯著降低(t分別為12.497和15.536，P 均 ＜0.01)，0.1 μmol/L 嗎啡組與 1.0 μmol/L 嗎啡組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.183，P ＞0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞生存素mRNA及蛋白表達(dá)的改變x ± s，n=18Tab 1 The expression of survivin mRNA and protein in different groups

圖1 RT-PCR法檢測(cè)生存素mRNA的表達(dá)Fig 1 RT-PCR analysis for detecting Survivin mRNA

圖2 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)Survivin蛋白的表達(dá)Fig 2 Western blot analysis for detecting Survivin protein

2.2 Livin mRNA和蛋白表達(dá)的改變

RT-PCR 結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，0.1 μmol/L嗎啡組livin mRNA表達(dá)顯著降低(t=12.458，P ＜0.01)，1.0 μmol/L 嗎啡組 livin mRNA 表達(dá)亦顯著降低(t=14.539，P ＜0.01)，0.1 μmol/L 嗎啡組與1.0 μmol/L嗎啡組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.844，P ＞0.05)，見(jiàn)圖3。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示相對(duì)分子質(zhì)量31 000蛋白條帶(圖4)。與對(duì)照組相比，0.1 μmol/L 嗎啡組與 1.0 μmol/L 嗎啡組livin蛋白表達(dá)均顯著降低(t分別為11.227和9.675，P 均 ＜ 0.01)，0.1 μmol/L 嗎啡組與 1.0 μmol/L嗎啡組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.837，P ＞0.05)，見(jiàn)表2。

圖3 RT-PCR法檢測(cè)livin mRNA的表達(dá)Fig 3 RT-PCR analysis for detecting livin mRNA

圖4 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)Livin蛋白的表達(dá)Fig 4 Western blot analysis for detecting Livin protein

表2 各組細(xì)胞livin mRNA及蛋白表達(dá)的改變x ± s，n=18Tab 2 The expression of livin mRNA and protein in different groups

2.3 MCF-7細(xì)胞增殖活性的改變

MTT 結(jié)果顯示，在嗎啡孵育 24 h 時(shí)，0.1 μmol/L嗎啡組和1.0 μmol/L嗎啡組D值比對(duì)照組均顯著降低，細(xì)胞增殖受到抑制，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t分別為13.874 和15.367，P 均 ＜0.01)，0.1 μmol/L嗎啡組與1.0 μmol/L嗎啡組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.984，P ＞0.05)。在嗎啡孵育 48 h 及72 h 時(shí)各組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表3。

表3 MTT檢測(cè)各組細(xì)胞的D值x ± s，n=18Tab 3 MTT analysis for detecting D value in different groups

2.4 MCF-7細(xì)胞凋亡的改變

流式細(xì)胞儀凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示，嗎啡孵育24 h 時(shí)，對(duì)照組、0.1 μmol/L 嗎啡組及1.0 μmol/L 嗎啡組凋亡率分別為(6.09±1.34)%、(12.98±3.15)%、(12.92 ±3.27)%。與對(duì)照組相比，0.1 μmol/L嗎啡組凋亡率顯著增加(t=18.375，P＜0.01)，1.0 μmol/L嗎啡組凋亡率亦顯著高于對(duì)照組(t=16.294，P ＜ 0.01)，0.1 μmol/L 嗎啡組與1.0 μmol/L嗎啡組凋亡率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.638，P ＞0.05)。見(jiàn)圖 5。

圖5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率Fig 5 Flow cytomertry for detecting cell apoptosis ratio

3 討論

Maneckjee 等［3］研究表明，0.1 ～1.0 μmol/L 嗎啡可抑制人肺腺癌細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞出現(xiàn)DNA碎裂、凋亡小體形成等凋亡的特征性變化。覃怡等［4］報(bào)道，10 μmol/L 嗎啡可抑制胃腺癌 MGC-803細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Ecimovic等［5］報(bào)道，嗎啡血漿濃度0.1 mol/L即可緩解乳腺癌患者疼痛，但用于癌痛治療時(shí)，個(gè)體差異較大，因此本研究中嗎啡濃度選擇為0.1 μmol/L 及1.0 μmol/L，在上述濃度嗎啡孵育乳腺癌MCF-7細(xì)胞后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MCF-7細(xì)胞凋亡率顯著升高，而細(xì)胞增殖顯著降低，提示嗎啡可促進(jìn)乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡并抑制其細(xì)胞增殖，這與Maneckjee及覃怡等報(bào)道結(jié)果基本一致。

生存素和livin是凋亡抑制因子(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族中近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的成員，在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，參與抑制細(xì)胞凋亡，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可作為腫瘤的早期診斷及預(yù)后評(píng)估的新靶點(diǎn)［6］。生存素還促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，參與細(xì)胞有絲分裂、血管生成和腫瘤細(xì)胞耐藥性的產(chǎn)生［7］。研究表明，生存素和 livin主要通過(guò)抑制Caspase的活性，阻斷其級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而抑制凋亡的進(jìn)程，另外也可通過(guò)激活TAKI/JNK1信號(hào)傳導(dǎo)途徑或參與TNF/NF-κB信號(hào)通路而發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用［8］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，用 0.1 μmol/L 及 1.0 μmol/L嗎啡孵育后，MCF-7細(xì)胞生存素和livin蛋白及mRNA表達(dá)均比對(duì)照組顯著減少，該結(jié)果提示嗎啡可能通過(guò)下調(diào)生存素和livin的表達(dá)而抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡。然而，對(duì)于嗎啡參與抑制惡性腫瘤的細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制還遠(yuǎn)未闡明。研究表明，嗎啡除可與細(xì)胞表面Fas受體結(jié)合，通過(guò)FADD/P53信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡，還與TNF/NF-κB細(xì)胞凋亡信號(hào)通路存在相互作用或相互串話(cross talk)［9］。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示我們，在今后進(jìn)一步研究嗎啡在乳腺癌細(xì)胞增殖及凋亡中所起作用時(shí)，還必須加強(qiáng)Fas信號(hào)通路與其他信號(hào)通路之間的相互關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究，才能從本質(zhì)上闡明其發(fā)生機(jī)制。

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