許斌，陳寅，戴桂紅，蔣小芹，王薇，趙國(guó)軍，于鴻

(泰州市人民醫(yī)院1.普外科，2.病理科，江蘇 泰州225000)

結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor，CTGF)是新發(fā)現(xiàn)的CCN家族成員，在人類(lèi)多種組織器官中廣泛表達(dá)，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、介導(dǎo)細(xì)胞黏附、刺激細(xì)胞遷移、促進(jìn)血管生成等生物學(xué)功能［1］。近年來(lái)的研究顯示CTGF的表達(dá)水平與多種惡性腫瘤的發(fā)生進(jìn)展、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移、腫瘤血管生成及預(yù)后密切關(guān)聯(lián)［2］。CTGF基因在惡性腫瘤中的作用已引起了越來(lái)越多研究者的重視，但目前對(duì)CTGF基因在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的具體機(jī)制并不十分明了。本實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將CTGF cDNA經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株，觀(guān)察轉(zhuǎn)基因細(xì)胞克隆基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)及基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-2(tissue inhibitor of metalloproteinase-2，TIMP-2)的表達(dá)及該克隆細(xì)胞增殖的改變，以進(jìn)一步探討CTGF對(duì)乳腺癌的作用機(jī)制，為今后對(duì)乳腺癌患者實(shí)施針對(duì)性基因治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所;DMEM、胎牛血清及無(wú)血清培養(yǎng)液購(gòu)于Gibco BRL公司;OneStep RT-PCR Kit購(gòu)于Qiagen公司;Trizol試劑及Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)于Sigma公司;鼠抗人MMP-2單克隆抗體及鼠抗人TIMP-2單克隆抗體購(gòu)于 Dako公司;羊抗人CTGF多克隆抗體及兔抗羊FITC-IgG購(gòu)于Santa Cruz公司;ABC試劑盒購(gòu)于Vector公司。PCR引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 脂質(zhì)體介導(dǎo)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染CTGF基因

pcDNA3.0-CTGF真核表達(dá)質(zhì)粒由臺(tái)北大學(xué)Min-liang Kuo博士饋贈(zèng)，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法酶切鑒定［3］，送測(cè)序(聯(lián)合基因公司)后擴(kuò)增。人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株培養(yǎng)按本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法進(jìn)行［4］。轉(zhuǎn)染前1 d，MCF-7細(xì)胞以2×106個(gè)/孔傳至6 cm培養(yǎng)皿內(nèi);12 h后，棄完全培養(yǎng)液，分別加入含有Lipofectamine 2000和CTGF真核表達(dá)質(zhì)?；蛑|(zhì)體和空載體pcDNA3.1混合物的無(wú)血清培養(yǎng)液4 ml;6 h后棄無(wú)血清培養(yǎng)液，改用10%胎牛血清完全培養(yǎng)液。

1.3 免疫熒光法檢測(cè)CTGF蛋白的表達(dá)

轉(zhuǎn)染結(jié)束后，冷丙酮固定細(xì)胞15 min，一抗為羊抗人多克隆抗體(1∶100)，二抗為兔抗羊FITC-IgG(1∶50)。熒光顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞內(nèi)熒光分布，并拍照記錄。

1.4 RT-PCR法檢測(cè)MCF-7細(xì)胞CTGF mRNA

轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，Trizol抽提總RNA，按照Qiagen公司試劑盒說(shuō)明書(shū)提供的步驟在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件:50℃逆轉(zhuǎn)錄30 min，95℃滅活逆轉(zhuǎn)錄酶15 min，94℃變性2 min，60℃復(fù)性1 min，72℃延伸1 min，共33個(gè)循環(huán)。RT-PCR引物如下:內(nèi)參照GAPDH上游5'-ACCACAGTCCATGCCATGCCATCAC-3';下游 5'-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為450 bp。CTGF上游5'-TGTGGAATGGGCATCTCC-3';下游5'-TTTCATGATCTCGCCATCG-3'，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為306 bp。MMP-2上游 5'-CTCAGCGGCTCATGGTCCGGCC-3';下游5'-CATGGTCCGGCCCCCGCCCCCA-3'，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為278 bp。TIMP-2上游5'-CTGTCCCCTCBCCTCTTCGC-3';下游5'-TCCACCTCCTTCTCGCTCACTG-3'，預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為303 bp。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)MMP-2和TIMP-2的表達(dá)

轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，常規(guī)抽提總蛋白，依標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行10%SDS-PAGE變性電泳，半干式電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。一抗分別為羊抗人CTGF多克隆抗體(1∶200)，鼠抗人MMP-2單克隆抗體(1∶200)，鼠抗人TIMP-2單克隆抗體(1∶200)。二抗分別為生物素化兔抗羊IgG及生物素化兔抗鼠IgG(1∶400，上海長(zhǎng)島公司)。

1.6 定量和統(tǒng)計(jì)分析

凝膠電泳用Kodak凝膠成像儀進(jìn)行拍照記錄，Kodak圖像分析軟件測(cè)定條帶光密度值。應(yīng)用SPSS 13.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)差(±s)計(jì)算和t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.0-CTGF的鑒定

重組真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.0-CTGF，測(cè)序結(jié)果顯示，與基因庫(kù)人CTGF序列 (GI∶325910844)完全一致。又經(jīng)EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切及EcoRⅠ單酶切鑒定，結(jié)果顯示重組質(zhì)粒構(gòu)建正確無(wú)誤(圖1)。

圖1 重組質(zhì)粒pcDNA3.0-CTGF的鑒定Fig 1 Confirming of recombinant plasmid pcDNA3.0-CTGF

2.2 轉(zhuǎn)染CTGF基因的MCF-7細(xì)胞免疫熒光法檢查

與 MCF-7及轉(zhuǎn)空載體的 MCF-7相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-CTGF的MCF-7，其胞質(zhì)熒光亮度明顯增強(qiáng)(圖2)。

2.3 RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法對(duì)轉(zhuǎn)基因MCF-7的鑒定

圖2 免疫熒光檢測(cè)CTGF蛋白表達(dá)(FITC標(biāo)記×200)Fig2 Immunofluorescence for detecting CTGF protein

RT-PCR結(jié)果表明，與空載體MCF-7細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染CTGF的MCF-7細(xì)胞CTGF mRNA表達(dá)水平明顯升高(t=8.264，P ＜0.01)(圖 3);蛋白質(zhì)印跡結(jié)果表明，轉(zhuǎn)CTGF的MCF-7細(xì)胞CTGF蛋白表達(dá)水平也明顯升高(t=9.387，P ＜0.01)，顯示相對(duì)分子質(zhì)量為38 000蛋白條帶(圖4)。該結(jié)果表明，經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)的上述基因轉(zhuǎn)染是成功的。詳見(jiàn)表1。

圖3 RT-PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞CTGF mRNA的表達(dá)Fig 3 RT-PCR analysis for detecting CTGF mRNA

圖4 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)CTGF蛋白表達(dá)Fig 4 Western blot analysis for detecting CTGF protein

表1 各組細(xì)胞CTGF mRNA和蛋白表達(dá)的變化ˉx ± s，n=5Tab1 The expressions of CTGF mRNA and protein in different groups

2.4 轉(zhuǎn)基因MCF-7 MMP-2和TIMP-2蛋白的表達(dá)

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染空載體MCF-7相比，轉(zhuǎn)染CTGF的MCF-7細(xì)胞MMP-2蛋白表達(dá)顯著增加(t=13.145，P ＜0.01)，顯示相對(duì)分子質(zhì)量為92 000蛋白條帶(圖5);MCF-7與轉(zhuǎn)染空載體MCF-7之間，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.248，P ＞0.05)。與轉(zhuǎn)染空載體 MCF-7相比，轉(zhuǎn)染 CTGF的MCF-7 TIMP-2蛋白表達(dá)顯著降低(t=11.852，P ＜0.01)，顯示相對(duì)分子質(zhì)量為21 000蛋白條帶(圖6);MCF-7與轉(zhuǎn)染空載體MCF-7之間，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.196，P ＞0.05)。詳見(jiàn)表2。

圖5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)MMP-2蛋白表達(dá)Fig 5 Western blot analysis for detecting MMP-2 protein

圖6 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)TIMP-2蛋白表達(dá)Fig 6 Western blot analysis for detecting TIMP-2 protein

3 討論

深入闡明乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，對(duì)于尋找新的干預(yù)靶點(diǎn)，為乳腺癌的治療提供新的線(xiàn)索具有重要意義。自從結(jié)締組織生長(zhǎng)因子于臍周靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)后，其逐步成為器官纖維化領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一，但越來(lái)越多的研究顯示，CTGF在腫瘤的形成與發(fā)展過(guò)程起著重要的作用，因此有望成為乳腺癌基因治療的有效靶點(diǎn)之一。Bennewith等［5］報(bào)道，CTGF的高表達(dá)與胰腺癌、食管癌、膠質(zhì)瘤、乳腺癌、胃癌、宮頸癌等患者的預(yù)后差密切相關(guān)，其機(jī)制可能為腫瘤細(xì)胞自身產(chǎn)生的CTGF可促進(jìn)該腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。Chen等［6］發(fā)現(xiàn)，CTGF通過(guò)整合素-細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(Integrin-ERK)信號(hào)通路促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移。Aikawa等［7］報(bào)道，乳腺癌中CTGF mRNA表達(dá)水平增高，可顯著增強(qiáng)癌腫侵襲與轉(zhuǎn)移能力，并顯著縮短患者生存時(shí)間。這些研究結(jié)果提示，CTGF在乳腺癌的進(jìn)展過(guò)程中起著重要的作用，CTGF在乳腺癌組織中的高表達(dá)提示乳腺癌患者預(yù)后差。

表2 各組細(xì)胞MMP-2及TIMP-2蛋白表達(dá)的變化ˉx ± s，n=5Tab 2 The expressions of MMP-2 and TIMP-2 protein in different groups

大量研究證實(shí)，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)和基底膜的降解和破壞是腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)，而這些組織結(jié)構(gòu)的破壞和降解需要相應(yīng)的基質(zhì)溶解酶參與?；|(zhì)溶解酶系統(tǒng)由一個(gè)龐大的蛋白溶解酶家族組成，也稱(chēng)基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng)，包括MMPs及相應(yīng)抑制劑TIMPs。MMP-2作為基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng)重要成員之一，通過(guò)降解和破壞ECM中的Ⅳ型膠原和明膠，利于腫瘤內(nèi)血管的形成與生長(zhǎng)，與多種惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移關(guān)系極為密切［7］。TIMP-2是MMP-2組織抑制因子，能抑制MMP-2活性，MMP-2/TIMP-2表達(dá)失衡將促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，并且TIMP-2表達(dá)增加往往與腫瘤侵襲能力下降及患者的預(yù)后較好相關(guān)［8］。本實(shí)驗(yàn)為探討CTGF在乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制，采用細(xì)胞轉(zhuǎn)基因技術(shù)，獲得穩(wěn)定高表達(dá)CTGF的乳腺癌細(xì)胞克隆，與對(duì)照組相比，該細(xì)胞克隆MMP-2表達(dá)增加，而TIMP-2表達(dá)降低，提示CTGF參與MCF-7細(xì)胞MMP-2及TIMP-2的合成代謝過(guò)程，并通過(guò)上調(diào)MMP-2的表達(dá)及下調(diào)TIMP-2的表達(dá)而促進(jìn)乳腺癌侵襲與轉(zhuǎn)移。然而，對(duì)于CTGF參與促進(jìn)惡性腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲及轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制還遠(yuǎn)未闡明。近年來(lái)，一些研究發(fā)現(xiàn)除TGF-β/Smad信號(hào)通路可調(diào)節(jié) CTGF的表達(dá)，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、ERK和C-Jun N末端激酶(JNK)與CTGF信號(hào)通路之間存在相互作用或相互串話(huà)(crosstalk)［9］。Kwon 等［10］報(bào)道，ras/MAP-ERK 信號(hào)通路依賴(lài)Smad4而顯著上調(diào)乳腺癌細(xì)胞CTGF的表達(dá)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示我們，在今后進(jìn)一步研究乳腺癌發(fā)生機(jī)制以及CTGF所起作用時(shí)，還必須加強(qiáng)CTGF信號(hào)通路與其他信號(hào)通路之間的相互關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究，才能從本質(zhì)上闡明其發(fā)生機(jī)制，從而有可能探索出更具有針對(duì)性和有效性的治療策略和方法。

［1］Phanish MK，Winn SK，Dockrell ME.Connective tissue growth factor-(CTGF，CCN2)-a marker，mediator and therapeutic target for renal fibrosis［J］.Nephron Exp Nephrol，2010，114(3):e83 －92.

［2］Dhar A，Ray A.The CCN family proteins in carcinogenesis［J］.Exp Oncol，2010，32(1):2 － 9.

［3］于鴻，陳琦，劉曄，等.轉(zhuǎn)染Smad7基因的大鼠腎小球系膜細(xì)胞對(duì)Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)的改變［J］.復(fù)旦學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2008，35(3):436 －440.

［4］許斌，肖蔚，焦霞，等.生存素反義寡核苷酸對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞株MMP-2及MMP-9表達(dá)的影響［J］.江蘇大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2011，21(3):203 －207.

［5］Bennewith KL，Huang X，Ham CM，et al.The role of tumor cell-derived connective tissue growth factor(CTGF/CCN2)in pancreatic tumor growth［J］.Cancer Res，2009，69(3):775－784.

［6］Chen PS，Wang MY，Wu SN，et al.CTGF enhances the motility of breast cancer cells via an integrin-alphavbeta3-ERK1/2-dependent S100A4-upregulated pathway［J］.J Cell Sci，2007，120(12):2053 －2065.

［7］Aikawa T，Gunn J，Spong SM，et al.Connective tissue growth factor-specific antibody attenuates tumor growth，metastasis，and angiogenesis in an orthotopic mouse model of pancreatic cancer［J］.Mol Cancer Ther，2006，5(5):1108－1116.

［8］Yang F，Jin C，Jiang YJ，et al.Potential role of soluble TIMP-2R-1 in antiangiogenesis therapy for cancer［J］.Expert Rev Anticancer Ther，2011，11(4):541 －549.

［9］Pickles M，Leask A.Analysis of CCN2 promoter activity in PANC-1 cells:regulation by ras/MEK/ERK［J］.J Cell Commun Signal，2007，1(2):85 － 90.

［10］ Kwon S，Munroe X，Crawley SC，et al.Expression of connective tissue growth factor in pancreatic cancer cell lines［J］.Int J Oncol，2007，31(4):693 － 703.