鳳 權(quán)，馬坤強(qiáng)，李 雙

(紡織面料安徽省高校重點(diǎn)實驗室 安徽工程大學(xué)，安徽 蕪湖 241000)

近年來，納米科學(xué)的迅速發(fā)展為酶的穩(wěn)定性使用和高效催化帶來了新的機(jī)遇.應(yīng)用靜電紡絲技術(shù)制備的納米纖維由于其具有比表面積大、空隙率高等諸多優(yōu)點(diǎn)開始在酶固定化領(lǐng)域得到關(guān)注.納米纖維和酶技術(shù)結(jié)合可制備納米酶催化劑，其納米結(jié)構(gòu)不僅能使酶長期保持活性穩(wěn)定，而且能有效提高酶在水相、有機(jī)相、油/水界面的催化效率，并使多酶體系催化反應(yīng)和輔酶再生成為可能[1].作為在食品、紡織、造紙、醫(yī)療和環(huán)保等領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用的過氧化氫酶，其固定化研究具有重要理論意義和應(yīng)用價值[2-7].

本研究以制得的PVA/PA6復(fù)合納米纖維為基體，利用其表面的羥基與環(huán)氧氯丙烷反應(yīng)，在復(fù)合納米纖維表面引入一定量的環(huán)氧基團(tuán),通過環(huán)氧基團(tuán)與過氧化氫酶的氨基反應(yīng)固定化過氧化氫酶，并研究固定化酶的存貯穩(wěn)定性，分析其生物催化的動力學(xué)過程.

1 實驗材料與設(shè)備

1.1 實驗材料

圖1 自制靜電紡絲裝置

過氧化氫酶(EC.1.11.1.6)購置于Sigma公司；88%磷酸、丙酮、氯化銅、氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、95%乙醇、考馬斯亮藍(lán)(G-250)、30% 過氧化氫，購于國藥化學(xué)試劑有限公司；環(huán)氧氯丙烷，購于上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；二甲基亞砜(DMSO)，購于無錫市亞盛化工有限公司.實驗中所有藥品皆為分析純，使用前未經(jīng)進(jìn)一步純化.

1.2 實驗設(shè)備

UV-6100S型紫外可見分光光度計(Mapada，上海)；S-4800場發(fā)射掃描電子顯微鏡(Hitachi，日本)；靜電紡絲裝置自制，主要包括進(jìn)樣系統(tǒng)、高壓直流電源、接收裝置和相應(yīng)的控制系統(tǒng)，如圖1所示.

2 實驗方法

2.1 靜電紡制備PVA/PA6復(fù)合納米纖維

用PVA/PA6質(zhì)量百分比為4%/12%的紡絲液，按文獻(xiàn)[8]提供的方法制備PVA/PA6復(fù)合納米纖維.

2.2 PVA/PA6復(fù)合納米纖維的環(huán)氧化反應(yīng)

稱取PVA/ PA6復(fù)合納米纖維膜，每份約0.05 g，精確稱量后分別放入15 mL的二甲基亞砜溶劑中，加入5 mL的環(huán)氧氯丙烷，NaOH為催化劑，調(diào)pH值為10，在搖床中振蕩反應(yīng)一段時間，轉(zhuǎn)速為120 r/min,反應(yīng)溫度為60 ℃，然后用2 mol/L的HCl滴定至中性，再用丙酮與蒸餾水洗凈，40 ℃真空干燥后備用.

準(zhǔn)確稱取一定量環(huán)氧反應(yīng)后的PVA/PA6復(fù)合納米纖維，加入過量的Na2S2O3溶液，室溫下于量瓶中反應(yīng)l h.以酚酞為指示劑，用0.2 mol/L的HCl滴定，可利用式Q=0.2N/M計算環(huán)氧基團(tuán)的含量.Q為環(huán)氧基團(tuán)的含量(mmol/g)，N為HCl滴定量(mL),M為復(fù)合納米纖維的質(zhì)量(g).同時，以未環(huán)氧反應(yīng)的PVA/PA6復(fù)合納米纖維進(jìn)行空白實驗.滴定反應(yīng)原理如下：

2.3 過氧化氫酶的固定量及活性分析

過氧化氫酶溶于濃度為50 mmol/L,pH值為7.0的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，配制成濃度為0.3 mg/mL的過氧化氫酶溶液.將經(jīng)過90 min的環(huán)氧化反應(yīng)、環(huán)氧基團(tuán)含量為1.4 mmol/g的PVA/PA6復(fù)合納米纖維放入50 mL的酶溶液中，在20 ℃下以120 r/min的速度振蕩4 h后取出，用PBS反復(fù)沖洗，然后將固定化酶的納米纖維膜4 ℃下儲存于PBS中待用.測定酶的固定量及固定化酶的活性，每次實驗平行測定3次，取平均值.

2.4 形貌分析

利用掃描電子顯微鏡對環(huán)氧化反應(yīng)后的PVA/PA6納米纖維進(jìn)行形貌觀察，分析環(huán)氧化過程對納米纖維結(jié)構(gòu)的影響.

2.5 固定化酶的穩(wěn)定性分析

將一批處于濕態(tài)的固定化酶膜和自由酶溶液(1 mg/mL)放置于4 ℃下保存，每隔一段時間取出一份樣品測定其活性，通過考察酶相對活性的變化研究酶的儲存穩(wěn)定性.相對活性按文獻(xiàn)[9]提供的方法計算，每次實驗平行測定3次，取平均值.

3 結(jié)果與討論

3.1 反應(yīng)時間對PVA/PA6復(fù)合納米纖維環(huán)氧化改性的影響

研究中，按照實驗方法的規(guī)定，將納米纖維與環(huán)氧氯丙烷分別反應(yīng)30 min,60 min,90 min,120 min,150 min與180 min，測量不同反應(yīng)時間下復(fù)合納米纖維中環(huán)氧基團(tuán)的含量，實驗結(jié)果見圖2.

圖2 反應(yīng)時間對環(huán)氧基團(tuán)含量的影響

根據(jù)實驗結(jié)果可以看出，隨著時間的推移，在反應(yīng)前期，環(huán)氧基團(tuán)的含量快速上升，大約90 min以后逐漸趨緩.

利用掃描電子顯微鏡對經(jīng)不同環(huán)氧化反應(yīng)時間的PVA/PA6納米纖維進(jìn)行形貌觀察，分析環(huán)氧化過程對納米纖維結(jié)構(gòu)的影響，電鏡圖片見圖3.

圖3 納米纖維膜的微觀形貌

由圖3可以看出，在反應(yīng)時間為90 min時，PVA/PA6復(fù)合納米纖維有輕度溶脹，但依舊保持良好的纖維形態(tài)；當(dāng)反應(yīng)時間達(dá)到150 min時，納米纖維才出現(xiàn)明顯溶脹，均勻纖細(xì)的納米纖維結(jié)構(gòu)遭到一定程度破壞.綜合分析環(huán)氧基團(tuán)的引入量和反應(yīng)過程中納米纖維的形態(tài)，可選擇90 min作為PVA/PA6復(fù)合納米纖維環(huán)氧化的反應(yīng)時間.

3.2 基于環(huán)氧化納米纖維的酶固載量及活力

以經(jīng)過90 min的環(huán)氧化反應(yīng)、環(huán)氧基團(tuán)含量為1.4 mmol/g的PVA/PA6復(fù)合納米纖維為載體，將其放入酶溶液進(jìn)行過氧化氫酶的固定.經(jīng)測定，環(huán)氧化PVA/PA6納米纖維對過氧化氫酶的固定量為42 mg/g(以干纖維計).固定化酶在不同濃度H2O2下的初始反應(yīng)速率見圖4.

圖4 不同濃度H2O2中過氧化氫酶初始反應(yīng)速率

實驗結(jié)果表明，隨著過氧化氫初始濃度的增加，自由酶和固定化酶的表觀催化反應(yīng)速率都隨之上升.與固定化酶相比，自由酶的活性上升幅度更大，這可能由于自由酶在溶液體系中具有更高的自由度，與底物有更多有效接觸的機(jī)會.而固定化酶則受到底物和產(chǎn)物擴(kuò)散速度的影響，其催化速率的變化與底物濃度的增加相比具有滯后性. 同時還可以看出，酶在固定化以后活力有一定的損失，這主要是由于在共價固定的過程中，酶的構(gòu)型和構(gòu)象都受到了一定程度的影響，進(jìn)而降低了酶的活力.與以往的實驗數(shù)據(jù)相比，該活力保留值是比較理想的[10-12].

3.3 固定化過氧化氫酶的反應(yīng)動力學(xué)

采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法，即將米氏方程化為倒數(shù)形式，用于求解催化過程的動力學(xué)參數(shù),如下式所示:

式中，v0為反應(yīng)初始速率，Vmax為最大反應(yīng)速率，[S]為底物濃度，Km為催化體系的特征常數(shù).

利用米氏方程對實驗結(jié)果進(jìn)行線性擬合并分析計算，分別求得自由酶和固定化酶的Vmax和Km，結(jié)果見表1.

表1 自由過氧化氫酶和固定化過氧化氫酶的動力學(xué)參數(shù)

根據(jù)測定結(jié)果可知，與自由酶相比，固定化酶的最大反應(yīng)速度Vmax有所下降，而米氏常數(shù)Km則有所上升.Vmax是指在一定的反應(yīng)條件下(如酶濃度、底物濃度、反應(yīng)溫度和pH值等)反應(yīng)體系可能達(dá)到的最大反應(yīng)速度.與自由酶相比，固定化酶的Vmax下降，這是由于酶蛋白在固定后，其大分子構(gòu)象發(fā)生了改變以及空間位阻效應(yīng)的增加所導(dǎo)致的.總體上，該載體與固定化酶之間呈現(xiàn)良好的親和性.

3.4 固定化酶與自由酶的貯存穩(wěn)定性

在4 ℃下，將一批處于濕態(tài)的固定有過氧化氫酶的納米纖維膜和自由酶溶液放置20 d，這期間，每隔2 d取出一份樣品測定其活性，研究酶的儲存穩(wěn)定性，實驗結(jié)果見圖5.

圖5 過氧化氫酶的存儲穩(wěn)定性

從實驗結(jié)果可以看出，在存儲20 d后，固定化酶的相對活性為55%，而自由酶的相對活性大幅下降，僅為17%.固定于Cu(Ⅱ)-PVA/PA6納米纖維上的過氧化氫酶與自由過氧化氫酶相比，呈現(xiàn)了較高的存儲穩(wěn)定性，良好的存儲穩(wěn)定性對固定化酶在工業(yè)上的應(yīng)用具有非常重要的意義.

4 結(jié)語

通過環(huán)氧化反應(yīng)制備環(huán)氧化PVA/PA6復(fù)合納米纖維，并以此為載體利用環(huán)氧鍵共價固定過氧化氫酶.環(huán)氧化PVA/PA6納米纖維對過氧化氫酶的固定量為42 mg/g(以干纖維計).經(jīng)酶催化反應(yīng)動力學(xué)分析，分別得到自由酶和固定化酶的Vmax值和Km值，反映了環(huán)氧化PVA/PA6納米纖維與固定化酶之間良好的生物親和性.通過對固定化過氧化氫酶的穩(wěn)定性分析,得出固定后過氧化氫酶存儲的穩(wěn)定性明顯提高.

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