張 強(qiáng)

三聚氰胺DNA適體的篩選研究

張 強(qiáng)

為了篩選識(shí)別三聚氰胺的DNA適體，于體外合成ssDNA文庫(kù)并固相化于瓊脂糖凝膠顆粒表面，將液相中三聚氰胺將與其結(jié)合的DNA分子從固相表面分離，進(jìn)而建立非固相化SELEX技術(shù)，最終獲得了三聚氰胺識(shí)別適體，并采用DNAMAN和RNA Structure軟件對(duì)適體進(jìn)行了一、二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)10輪篩選，ssDNA文庫(kù)與三聚氰胺的親和力呈上升趨勢(shì)，隨機(jī)挑選的20個(gè)陽(yáng)性克隆適體根據(jù)一級(jí)結(jié)構(gòu)的同源性可分為4個(gè)家族，二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)以莖環(huán)結(jié)構(gòu)為主，表明篩選得到識(shí)別三聚氰胺的DNA適體。

三聚氰胺；適體；食品安全；檢測(cè)技術(shù)

小分子污染物問(wèn)題已經(jīng)成為世界各國(guó)普遍關(guān)注的食品安全問(wèn)題之一，近年來(lái)頻發(fā)的三聚氰胺食品安全事件讓人們意識(shí)到了此類問(wèn)題的嚴(yán)重性，更使人們意識(shí)到發(fā)展針對(duì)小分子污染物的新型檢測(cè)技術(shù)的重要性[1]?；诤怂徇m體(一種新型分子識(shí)別元件)的檢測(cè)技術(shù)近年來(lái)發(fā)展迅速[2-3]。但是，核酸適體檢測(cè)技術(shù)才在食品安全領(lǐng)域剛剛起步，目前還沒(méi)有關(guān)于三聚氰胺核酸適體篩選和應(yīng)用的報(bào)道。本研究旨在采用小分子非固相化SELEX技術(shù)，篩選識(shí)別三聚氰胺的DNA適體，為三聚氰胺適體檢測(cè)技術(shù)的開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 DNA序列

研究中所使用的DNA序列如表1所示，均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

表1 研究中使用的DNA序列

注：Library兩端是引物結(jié)合區(qū)，中間用來(lái)固定適體庫(kù)。N10和N20表示ssDNA庫(kù)的隨機(jī)區(qū)。

1.2 試劑與儀器

Thermo鏈霉親和素凝膠：南京生興公司；TaqMix：東盛生物公司；TA克隆試劑盒：北京康為世紀(jì)生物有限公司；DNA Marker：東盛生物公司；Trans 10感受態(tài)細(xì)胞：北京全式金生物技術(shù)有限公司；三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品：Augsburg公司；Sartorius；高速冷凍離心機(jī)：Thermo；微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：GE Helthcare；LB940多功能微孔板分析儀：德國(guó)Berthold；Costar 3915黑色96孔板：美國(guó)Costar公司；JS-680D全自動(dòng)凝膠成像分析儀：上海培清科技有限公司。

1.3 SELEX篩選

(1)隨機(jī)適體庫(kù)的固定 第一輪：將2.0nmol ssDNA文庫(kù)、10.0nmol B-B以及2.5nmol P1和P2溶于200μl SB溶液(300mmol/L NaCl，50mmol/L KCl，10mmol/L MgCl2，50mmol/L Tris，pH8.3)后，90℃變性3min，4℃孵育過(guò)夜；第二輪及以后：根據(jù)實(shí)際投入ssDNA的量，按照ssDNA∶P1∶P2∶B-B為1∶1.5∶1.5∶5溶于200μl SB后，90℃變性3min，室溫退火30min。取200μl鏈親和素修飾的瓊脂糖凝膠于離心柱中，用SB洗滌5次，加入孵育過(guò)夜的溶液，在旋轉(zhuǎn)混合器上作用40min，然后將凝膠與液相離心分離。

(2)三聚氰胺洗脫特異性結(jié)合的ssDNA SB洗滌上述固定好的凝膠10次。用200μl 0.5mmol/L的三聚氰胺與固定好的ssDNA文庫(kù)在旋轉(zhuǎn)混合器上室溫孵育40min，然后將凝膠與液相離心分離，液相中的ssDNA即為篩選的目標(biāo)ssDNA。

(3)PCR擴(kuò)增 利用2×TaqMix進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增時(shí)上、下游引物分別為F-P3和P2-B，每輪對(duì)引物的添加量、模板的添加量和循環(huán)輪數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物。

(4)dsDNA的拆分 將PCR擴(kuò)增得到的dsDNA與鏈霉親和素標(biāo)記的凝膠孵育，加入NaOH 200μl，在混合器上室溫孵育15min，使dsDNA堿變性解鏈，然后600g離心1min，收集濾液。

1.4 TA克隆與測(cè)序

按照北京康為世紀(jì)生物有限公司的TA克隆試劑盒的使用說(shuō)明進(jìn)行，隨機(jī)挑選20個(gè)陽(yáng)性克隆，送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.5 序列分析及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

采用DNAMAN軟件對(duì)篩選到的ssDNA進(jìn)行一級(jí)結(jié)構(gòu)序列比對(duì)，采用RNA structure軟件對(duì)ssDNA進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 每輪適體篩選的效率

圖1 每輪篩選的效率

本研究進(jìn)行了10輪的適體篩選，每輪的篩選效率如圖1所示。從圖1可以看出，在第2輪篩選時(shí)的篩選效率僅僅1.5%，隨著篩選輪數(shù)的增加，洗脫的ssDNA在逐步富集，篩選效率逐步增加；但在第10輪篩選時(shí)，篩選效率幾乎不再增加，此時(shí)篩選效率達(dá)到70.4%。

2.2 克隆測(cè)序及一級(jí)結(jié)構(gòu)

將第10輪的洗脫產(chǎn)物PCR擴(kuò)增后，利用試劑盒參照說(shuō)明書進(jìn)行TA克隆。隨機(jī)挑取20個(gè)陽(yáng)性克隆送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定(表2)。經(jīng)DNAMAN軟件分析，20個(gè)ssDNA序列分為4個(gè)家族(SS1、SS2、SS3、SS4)。

表2 篩選到的ssDNA序列

2.3 二級(jí)結(jié)構(gòu)

采用RNA structure軟件對(duì)SS1、SS2、SS3和SS4二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析(圖2)，可以看出，這4條序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以莖環(huán)結(jié)構(gòu)為主。SS1形成雙莖環(huán)，環(huán)中均含有1個(gè)“GTT”序列；SS2形成“Y“字結(jié)構(gòu)，其中長(zhǎng)莖連接環(huán)及共同形成環(huán)中含有1個(gè)“GTT”序列；SS3和SS4中均含有1個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)，并且環(huán)中各有1個(gè)“GTT”序列；這些莖環(huán)可能是適體與三聚氰胺結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，莖環(huán)結(jié)構(gòu)中的莖可能起到穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的作用，環(huán)則直接與靶分子結(jié)合，具體的結(jié)合位點(diǎn)還不清楚。

圖2 ssDNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)

3 討論

傳統(tǒng)的針對(duì)小分子物質(zhì)適體篩選的SELEX技術(shù)，通常采用固相化小分子的策略，對(duì)小分子的分子結(jié)構(gòu)具有一定要求，且篩選效果很難達(dá)到預(yù)期目的。本研究針對(duì)三聚氰胺核酸適體進(jìn)行篩選時(shí)，借鑒Nutiu等[4]報(bào)道的非固相化小分子的適體SELEX篩選策略，并將Nutiu等使用的放射性標(biāo)記的方法進(jìn)行改進(jìn)，采用熒光標(biāo)記的上游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)拆分獲得的次級(jí)庫(kù)是帶有熒光標(biāo)記的ssDNA，這樣就通過(guò)熒光檢測(cè)非常簡(jiǎn)便地監(jiān)控篩選過(guò)程，避免了放射性的操作，并且可以通過(guò)比較篩選時(shí)投入和洗脫的ssDNA的熒光強(qiáng)度來(lái)估算適體篩選的效率。這種非固相化小分子的適體篩選策略省了小分子改造固定的過(guò)程，大大提高了適體的篩選效率，并且有可能同時(shí)篩選到針對(duì)單個(gè)靶分子的特異性適體和針對(duì)多個(gè)靶分子的廣譜型核酸適體。

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10.3969/j.issn.1673-1409(S).2012.07.013

R155

A

1673-1409(2012)07-S047-03

2012-07-02

中國(guó)博士后科學(xué)基金(20090451177)；江蘇省博士后科研資助項(xiàng)目(0802023B)。

張 強(qiáng)(1979-)，男，山東濟(jì)南人，博士，助理研究員，研究方向營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)。

劉賢金，E-mail:jaasliu@jaas.ac.cn。