廖 凱，楊代勤，阮國良，孟 冉，袁漢文

(長江大學動物科學學院，湖北 荊州 434025)

黃鱔ERα cDNA的克隆與序列分析

廖 凱，楊代勤，阮國良，孟 冉，袁漢文

(長江大學動物科學學院，湖北 荊州 434025)

運用RT-PCR和5’RACE技術(shù)獲得黃鱔(Monopterusalbus)ERα cDNA,長度為1989bp,其開放閱讀框(ORF)包含1518個堿基序列，共編碼506個氨基酸。5’UTR長度為152bp，獲得的3’UTR長度為319bp。蛋白質(zhì)序列同源性分析顯示，黃鱔ERα與鱸形目魚類ERα相似性較高，與舌齒鱸(Dicentrarchuslabrax)、大口黑鱸(Micropterussalmoides)、石斑魚(Epinepheluscoioides)、金頭鯛(Sparusaurata)、尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)和底鳉(Fundulusheteroclitus)相似性分別為74.9%、73.5%、68.8%、68.2%、66.8%和65.6%。蛋白質(zhì)序列分析發(fā)現(xiàn)，黃鱔ERα 175～257和308～456個氨基酸分別為雌激素受體超家族功能域DBD和LBD。進化樹分析顯示，黃鱔ERα和其他魚類ERα聚為一支。

黃鱔(Monopterusalbus)；ERα；克??；序列分析

雌激素(estrogen)是具有廣泛生理功能的性類固醇激素，它在調(diào)節(jié)生長發(fā)育、繁殖和各種疾病發(fā)生中起著重要作用。雌激素的各種生理功能通過雌激素受體(estrogen receptors，ERs)介導來實現(xiàn)。哺乳動物ERs存在2種亞型，ERα和ERβ，它們是位于不同染色體上的不同基因編碼的產(chǎn)物。由于基因組復制事件的發(fā)生，硬骨魚類ERs種類比哺乳動物更為復雜，目前發(fā)現(xiàn)ERβ在大多數(shù)硬骨魚類中存在異型體(ERβ1和ERβ2)，同時ERα異型體(ERα1和ERα2)在虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[1]和倒刺鲃(Spinibarbusdenticulatus)[2]等魚類中已有報道。ERs作為核受體超家族一員，主要通過與核內(nèi)雌激素反應(yīng)元件(estrogen response elements，EREs)結(jié)合而調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。

雌激素在性腺發(fā)育、性別分化和繁殖中起著關(guān)鍵作用。在魚類中，ERs在精巢和卵巢有著廣泛的表達[3-6]，這表明ERs在魚類繁殖和性腺發(fā)育中起著重要作用。對魚類ERs基因的研究將有助于理解雌激素在魚類繁殖中的生理功能及其作用機制。目前，已有10余種魚類ERα cDNA報道，如尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)[3]、奧利亞羅非魚(Oreochromisaureus)[4]、金魚(Carassiusauratus)[5]、日本鰻鱺(Anguillajaponica)[7]、斑點叉尾鮰 (Ictaluruspunctatus)[8]、斑馬魚(Daniorerio)[9]、金頭鯛(Sparusauratus)[10]、大西洋絨須石首魚(Micropogoniasundulatus)[11]、舌齒鱸(Dicentrarchuslabrax)[12]、大西洋鮭(Salmosalar)[13]、石斑魚(Epinepheluscoioides)[6]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[14]、倒刺鲃(Spinibarbusdenticulatus)[2]等。黃鱔(Monopterusalbus)作為我國重要的淡水名特水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類，規(guī)?；B(yǎng)殖受到苗種資源短缺的制約，其特殊的繁殖生物學特性(性逆轉(zhuǎn))是黃鱔苗種人工繁殖的主要困難之一。已有研究[15-16]表明，外源性雌激素可以延緩黃鱔性逆轉(zhuǎn)。克隆黃鱔ERα基因可為理解雌激素在黃鱔性逆轉(zhuǎn)中的作用打下基礎(chǔ)，為黃鱔人工繁殖提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料

用于RNA提取的黃鱔來自長江大學黃鱔研究所，體重約95g，無傷病。RNA提取試劑盒、T載體及PCR試劑購自Takara公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas公司。質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒為Omega公司產(chǎn)品。大腸桿菌 (Escherichiacoli) DH5α購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司。5’RACE試劑盒由Clontech公司生產(chǎn)。其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 黃鱔RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

取黃鱔卵巢組織，用RNA提取試劑盒提取總RNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。然后參照Fermentas公司的ReverAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit方法合成cDNA。

1.3 引物設(shè)計

根據(jù)NCBI上黃鱔ERα部分片段序列(登錄號：AY686635.1)設(shè)計特異性引物，根據(jù)真金鯛(Chrysophrysmajor)(登錄號：AB007453.1)、加州鱸(Micropterussalmoides)(登錄號：AF253062.2)、金頭鯛(登錄號：AJ006039.1)、石斑魚(登錄號：GU721076.1)、黑棘鯛(Acanthopagrusschlegelii)(登錄號：AY074780.1)的ERα序列設(shè)計同源引物。引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物設(shè)計軟件采用Primer5.0。引物序列及用途見表 1。

表1 擴增黃鱔ERα cDNA序列所用引物

1.4 黃鱔ERα序列的擴增

1.4.1 ERα5’cDNA的擴增

按照BD SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit說明書方法合成5’RACE cDNA模板，用特異性引物(5’-RACE-R1和5’-RACE-R2)與BD SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit 5’RACE引物(UPM)進行半巢式PCR擴增。PCR反應(yīng)體系：模板cDNA 1μl，10×buffer 2.5μl，10mmol/L dNTPs 0.5μl，上、下游引物(10mol/L)各1μl,Tap DNA聚合酶1U，加雙蒸水至25μl。PCR反應(yīng)條件為：94℃預變性4min；然后進行30個循環(huán)，94℃變性30s，68℃退火30s，72℃延伸1min；最后延伸7min。PCR產(chǎn)物純化后連接到PMD18-T載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞DH5α，用氨芐抗性篩選后送至上海生工生物測序。

1.4.2 ERα下游編碼區(qū)擴增

以DNA為模板，以特異性引物ERα3F和同源引物ERα3R為引物，擴增ERα下游編碼區(qū)。反應(yīng)條件為：94℃預變性4min；然后進行30個循環(huán)，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min；最后延伸7min。其他處理同1.4.1。

1.5 黃鱔ERα序列分析

開放閱讀框(ORFs)分析及蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)預測在ORF finder server (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf.html)上進行。使用Meg 4.0軟件中的clustal W 方法對黃鱔ERα基因編碼的氨基酸進行進化樹的構(gòu)建，靴值重復設(shè)置為1000，用于評價進化樹的可靠性。氨基酸序列同源性分析使用DNAStar軟件MegAlign功能進行。

2 結(jié)果與分析

2. 1 黃鱔ERα序列及推導氨基酸序列

運用RT-PCR和5’RACE獲得黃鱔ERα cDNA，長度為1989bp，其開放閱讀框(open reading fragment，ORF)包含1518個堿基序列，共編碼506個氨基酸。5’UTR長度為152bp，獲得的3’UTR長度為319bp。蛋白質(zhì)序列分析發(fā)現(xiàn)，黃鱔ERα 的175～257和308～456個氨基酸分別為雌激素受體超家族功能域DBD(DNA binding domain)和LBD(Ligand binding domain)(圖 1)。

下劃線示起始密碼子和終止密碼子；方框示黃鱔ERα保守功能域DBD；灰色陰影部分示黃鱔ERα保守功能域LBD

2. 2 黃鱔ERα進化樹

利用NCBI上其他魚類ERs和黃鱔ERα，采用MEGA4.0構(gòu)建進化樹，結(jié)果如圖2。從圖2可以看出，魚類ERs分為ERα和ERβ 2個大支，ERβ1和ERβ2分別聚為2束，共同組成ERβ一支，ERα另成一支，黃鱔ERα與其他魚類ERα在一起。

圖2 ER s cDNA編碼的氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹

黑體加粗字體顯示為黃鱔。用于構(gòu)建進化樹的ERs蛋白GenBank登錄號為：斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)(ERα：ADK90033.1，ERβ1：ADK90034.1，ERβ2：ADK90035.1)；人(Homosapiens)(ERα：spP11474.3，ERβ：NP_004443.3)；斑馬魚(Daniorerio)(ERα：AAK16740.1，ERβ1：AAK16742.1，ERβ2：CAC93849.1)；金魚(Carassiusauratus)(ERα1：AAL12298.1，ERα2：AAR17610.1，ERβ1：AAD26921.1，ERβ2：AAF35170.1)；虹鱒(Oncorhynchusmykiss)(ERα1：P16058.3，ERα2：ABA60432.1，ERβ1：ABA60433.1，ERβ2：ABB73309.1)；尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)(ERα：Q9YH33.1，ERβ1：Q9YH32.1，ERβ2：ABE73151.1)；奧利亞羅非魚(Oreochromisaureus)(ERα：CAA63774.1，ERβ1：ACF75102.1，ERβ2：ACF75103.1)；底鳉(Fundulusheteroclitus)(ERα：AAT72914.1，ERβ1：AAU44352.1，ERβ2：AAU44353.1)；大口黑鱸(Micropterussalmoides)；(ERα：AAG44622.2，ERβ1：AAO39210.1，ERβ2：AAO39211.1)；大西洋絨須石首魚(Micropogoniasundulatus)(ERα：AAG16713.1，ERβ1：AAG16711.1，ERβ2：AAG16712.1)；舌齒鱸(Dicentrarchuslabrax)(ERα：CAD43599.1，ERβ1：CAD33851.1，ERβ2：CAD33852.1)；金頭鯛(Sparusaurata)(ERα：CAB51479.1，ERβ1：AAD31033.1，ERβ2：CAE30470.1)；黑鯛(Acanthopagrusschlegelii)(ERα：AAL82743.1，ERβ1：AAL82742.1，ERβ2：ABY60988.1)。

3 討論

本研究克隆了黃鱔雌激素受體α(ERα)亞型整個閱讀框和5’非翻譯區(qū)(UTR)。蛋白質(zhì)序列同源性分析表明，黃鱔ERα與鱸形目ERα相似性較高，與舌齒鱸、大口黑鱸、石斑魚、金頭鯛、尼羅羅非魚和底鳉相似性分別為74.9%、73.5%、68.8%、68.2%、66.8%和65.6%，與鯉科魚類ERα相似性為50%～60%之間，與人ERα相似性僅30.3%。

雌激素受體(ERs)作為核受體超家族成員之一，通過DBD結(jié)構(gòu)域與目的基因上游調(diào)控序列結(jié)合而調(diào)節(jié)目的基因的轉(zhuǎn)錄。DBD由2個含有4 Cys殘基的鋅指結(jié)構(gòu)組成[17]。LBD 是ERs家族另一個重要的功能域，雌激素通過與LBD結(jié)合從而激活ERs介導的一系列基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控反應(yīng)[18]。DBD和LBD具有很強保守性[19]。蛋白質(zhì)序列分析表明，黃鱔ERα具有DBD和LBD2個重要功能域。

高等脊椎動物只存在2種類型ERs，魚類ERs比高等脊椎動物更為復雜，存在多種亞型。目前以確定魚類具有ERβ1、ERβ2和ERα3種類型，雖然在NCBI網(wǎng)站上能找到金魚和虹鱒ERα2序列，魚類ERs氨基酸進化樹表明，金魚、虹鱒ERα2與其他魚類ERα聚為一支，魚類是否存在ERα2還有待于進一步驗證。魚類ERs各種類型在繁殖中的功能目前還不清楚，已有研究[2,6,9,11-12]表明，魚類ERβ1、ERβ2和ERα在繁殖軸中有著不同的表達譜和生理功能。黃鱔作為我國重要的淡水名特水產(chǎn)養(yǎng)殖品種，其繁殖生理值得研究。本研究克隆了黃鱔ERα cDNA序列并對其結(jié)構(gòu)進行了分析，下一步將對黃鱔ERα在繁殖中的生理功能進行研究。

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10.3969/j.issn.1673-1409(S).2012.07.010

Q781；Q959.482

A

1673-1409(2012)07-S036-06

2012-07-02

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(NO.201003076)。

廖 凱(1987-)，男，湖北咸豐人，碩士生，研究方向為魚類繁殖生理。

楊代勤，E-mail：yangdaiq@163.com。