李寧，董海洲，王兆升，李鐘濤，李睿

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 泰安，271018)

“雞皮糙”山藥產(chǎn)自山東省菏澤市陳集鎮(zhèn)，粉性足、多須根、質(zhì)膩、味甘甜、質(zhì)地硬、入水久煮不散、不易折斷、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，現(xiàn)已申請(qǐng)了國(guó)家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品［1］。但在山藥加工和貯藏過(guò)程中往往產(chǎn)生劇烈褐變，失去原有的乳白色澤，嚴(yán)重影響產(chǎn)品的外觀、風(fēng)味及商品價(jià)值。果蔬的褐變主要由酶促褐變引起，與酶促褐變密切相關(guān)的酶類(lèi)主要有多酚氧化酶(PPO)和POD［2］。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)山藥酶促褐變的研究主要集中在PPO上，但Chilaka等人認(rèn)為，POD在山藥褐變上也起著重要作用［3］。

POD是廣泛分布于植物中的一類(lèi)氧化還原酶，可催化由過(guò)氧化氫參與的各種還原物質(zhì)的氧化反應(yīng)。它能催化過(guò)氧化物對(duì)酚類(lèi)物質(zhì)的氧化，導(dǎo)致組織褐變［4］。果蔬中大部分的風(fēng)味改變和褐變與POD活力有關(guān)，POD的活力改變明顯地影響果蔬產(chǎn)品的質(zhì)量［5］。目前，關(guān)于“雞皮糙”山藥POD酶學(xué)特性的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究以新鮮“雞皮糙”山藥為材料，對(duì)其POD進(jìn)行較為系統(tǒng)的酶學(xué)特性研究，以期為控制過(guò)氧化物酶引起的酶促褐變、減少其營(yíng)養(yǎng)損失提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

“雞皮糙”山藥:產(chǎn)地為菏澤市陳集鎮(zhèn)，新鮮優(yōu)質(zhì)(無(wú)病蟲(chóng)害及機(jī)械損傷)。

1.2 試劑與儀器

PVP(交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮)、Na2HOP4、檸檬酸、愈創(chuàng)木酚、H2O2、NaHSO3、草酸、EDTA-2Na(乙二胺四乙酸二鈉)、抗壞血酸、L-半胱氨酸等，均為分析純。

研缽、數(shù)顯恒溫水浴鍋、TGL16臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、AY202型電子天平、PHS-25型酸度計(jì)、T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)。

1.3 方法

1.3.1 “雞皮糙”山藥POD酶液的制備

稱(chēng)取清洗去皮后的“雞皮糙”山藥10 g于研缽中，加入2%的PVP、50 mL 0.1 mol/L pH 6.0的檸檬酸－磷酸鹽緩沖液在冰浴條件下研磨成漿，4℃下浸提30 min后用4層紗布過(guò)濾。使用冷凍離心機(jī)以4 000 r/min將濾液離心15 min，取上清液，上清液即為POD粗酶液。

1.3.2 POD 活性的測(cè)定［6］

取pH6.0檸檬酸－磷酸緩沖液(0.1 mol/L)1.7 mL，分別加入1 mL濃度為40 mmol/L愈創(chuàng)木酚和濃度為40 mmol/L H2O2溶液(其最終體系中濃度為10 mmol/L)混勻，25℃下保溫5 min，加入0.3 mL POD粗酶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，對(duì)照組以緩沖液代替酶液。在470 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度的變化，每隔30 s記錄1次，共計(jì)3 min。1個(gè)酶活力單位定義為:測(cè)定條件下，每分鐘每毫升酶液使吸光度值改變0.001為1個(gè)酶活力單位(U)。

1.3.3 pH值對(duì)POD活性的影響

用檸檬酸－磷酸鹽緩沖液調(diào)整反應(yīng)體系的pH(2、3、4、5、6、7、8、9、10)，在 25℃條件下測(cè)定 POD 活力，以酶活力最高值為100%，計(jì)算相對(duì)酶活，研究pH值對(duì)POD活性的影響。

1.3.4 溫度對(duì)POD活性的影響

在最適pH條件下，調(diào)節(jié)反應(yīng)體系溫度(10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65℃)按 1.3.2 酶活測(cè)定方法分別測(cè)定POD酶活力，以酶活力最高值為100%，計(jì)算相對(duì)酶活，研究溫度對(duì)POD活性的影響。

1.3.5 POD的熱穩(wěn)定性

將 POD 酶液分別置于 60、70、80、90、100℃ 水浴中保溫 5、10、15、20、25、30 min 后，迅速冷卻，按1.3.2酶活測(cè)定方法測(cè)定POD殘留活性。

1.3.6 不同濃度H2O2對(duì)POD活性的影響

在測(cè)定酶活力的反應(yīng)體系中，調(diào)節(jié)H2O2濃度(0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 mmol/L)，研究不同濃度H2O2對(duì)POD活性的影響。

1.3.7 POD的底物專(zhuān)一性

分別以鄰苯二酚、綠原酸、沒(méi)食子酸、焦性沒(méi)食子酸和愈創(chuàng)木酚為反應(yīng)底物，研究不同酚類(lèi)底物對(duì)POD活性的影響。根據(jù)Lineweaver-Burk方程1/V=Km/Vmax{1/［s］}+1/Vmax，利用雙倒數(shù)作圖法，分別計(jì)算“雞皮糙”山藥POD對(duì)不同酚類(lèi)底物的米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vmax，底物親和力大小用Vmax/Km表示［7］。

1.3.8 金屬離子對(duì)POD活性的影響

在測(cè)定酶活力的反應(yīng)體系中加入不同的金屬離子至終濃度分別為1 mmol/L和10 mmol/L，按1.3.2酶活測(cè)定方法測(cè)定POD殘留活性。研究不同金屬離子對(duì)POD活性的影響。

1.3.9 不同抑制劑對(duì)POD活性的影響

在測(cè)定酶活力的反應(yīng)體系中加入不同濃度的Vc、NaHSO3、L-半胱氨酸、草酸、EDAT-2Na、檸檬酸、植酸等抑制劑，按1.3.2酶活測(cè)定方法測(cè)定POD殘留活性。研究不同抑制劑對(duì)POD活性的影響。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值，利用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH值對(duì)POD活性的影響

如圖1所示，當(dāng)pH小于3.0時(shí)，隨pH的升高，POD活性增加緩慢;pH大于3.0時(shí)，POD活性快速增加，當(dāng)pH為4.0時(shí)POD活性達(dá)到最大;此后，隨著pH的繼續(xù)增加，其活性迅速下降，故“雞皮糙”山藥POD最適pH為4.0。當(dāng)pH小于3時(shí)，80%以上的POD活性被抑制;pH大于8時(shí)，約有70%的POD活性被抑制。由此可知，在“雞皮糙”山藥加工過(guò)程中，可以將pH調(diào)節(jié)在其活力相對(duì)較低的范圍內(nèi)，從而有效控制POD引起的酶促褐變。

圖1 pH對(duì)POD活性的影響

2.2 溫度對(duì)POD活性的影響

如圖2所示，在10～35℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，POD酶活性逐漸升高，35℃時(shí)酶活性達(dá)到最大，隨著溫度的繼續(xù)升高，酶活性又開(kāi)始呈下降趨勢(shì)，并且溫度高于60℃時(shí)，POD活性急速下降。這說(shuō)明“雞皮糙”山藥POD的最適溫度為35℃，采用較高溫度進(jìn)行燙漂可以達(dá)到抑制POD活性的目的?！半u皮糙”山藥POD的最適溫度與馬鈴薯、花菜 POD的不同［8］，表明不同種類(lèi)果蔬POD的最適溫度是有差異的。趙喜亭等人的研究指出，山藥POD的最適溫度為50℃［9］，本研究結(jié)果與之存在較大差異，這可能與山藥的品種等因素有關(guān)。

圖2 溫度對(duì)POD活性的影響

2.3 POD的熱穩(wěn)定性

如圖3所示，“雞皮糙”山藥POD的活性隨加熱時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，并且溫度越高活性下降趨勢(shì)越明顯。60℃水浴處理5 min，POD殘留酶活51%，處理30 min時(shí)仍有20%的殘留酶活;80℃水浴處理5 min，POD殘留酶活降至34.4%，處理30 min殘留酶活僅為5.9%;當(dāng)溫度達(dá)到100℃時(shí)，處理5 min POD殘留酶活僅為17.1%，處理20 min則可使POD完全失活。因此，生產(chǎn)加工過(guò)程中可采用沸水燙漂的方式抑制POD活性。

圖3 POD的熱穩(wěn)定性

2.4 不同濃度H2O2對(duì)POD活性的影響

如圖4所示，在0～10 mmol/L范圍內(nèi)，隨著H2O2濃度的增加，POD活性迅速上升，當(dāng)H2O2濃度達(dá)到10 mmol/L時(shí)POD活性最高，隨著H2O2濃度的進(jìn)一步增加，POD活性又出現(xiàn)下降趨勢(shì)。有研究表明，在植物體內(nèi)，POD的催化作用受H2O2濃度的影響，當(dāng)H2O2達(dá)到一定濃度時(shí)，POD能夠發(fā)揮較大的催化作用，而超過(guò)這一濃度后，POD 的活性就會(huì)降低［8，10］。本研究也證明了這一點(diǎn)。

圖4 不同濃度H2O2對(duì)POD活性的影響

2.5 POD的底物專(zhuān)一性

根據(jù)Lineweaver-Burk方程1/V=Km/Vmax{1/［s］}+1/Vmax，計(jì)算出“雞皮糙”山藥 POD 對(duì)不同酚類(lèi)底物的Km和Vmax，采用Vmax/Km比值表示POD與底物親和力的大小，比值越大表明親和力就越大［7］。由表1可知，以綠原酸為底物時(shí)，其Km值最小、Vmax值最大，Vmax/Km比值最大。因此，綠原酸與“雞皮糙”山藥POD的親和力最大。而以沒(méi)食子酸為底物時(shí)，酶與底物基本無(wú)反應(yīng)。根據(jù)Vmax/Km比值的大小，“雞皮糙”山藥POD與各底物親和力小依次為:綠原酸＞愈創(chuàng)木酚＞焦性沒(méi)食子酸＞鄰苯二酚＞沒(méi)食子酸。這與鐵棍山藥POD的底物親和性研究結(jié)果不同［9］。由此可以看出，同一果蔬不同的品種，其POD最適底物也存在差異。

表1 “雞皮糙”山藥POD氧化不同酚類(lèi)底物的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

2.6 金屬離子對(duì)POD活性的影響

如圖5所示，不同金屬離子對(duì)“雞皮糙”山藥POD活性的影響存在很大差異。其中，Ca2+、Ba2+、Fe2+、Mg2+對(duì)POD有明顯的激活作用，并且隨濃度的增加激活作用增強(qiáng);Na+具有一定的抑制作用;Mn2+、K+對(duì) POD則具有明顯的抑制作用;低濃度(1.0 mmol/L)的Zn2+、Cu2+對(duì)POD有激活作用，而高濃度(10 mmol/L)的Zn2+、Cu2+則有一定的抑制作用。

圖5 金屬離子對(duì)POD活性的影響

2.7 不同抑制劑對(duì)POD活性的影響

如圖6所示，不同濃度的抑制劑對(duì)“雞皮糙”山藥POD活性均有不同程度的抑制作用，并且抑制作用隨抑制劑濃度的增加而增強(qiáng)。其中，檸檬酸、EDTA-2Na和NaHSO3對(duì)POD活性的抑制作用較弱，濃度為10 mmol/L時(shí)仍有50%以上的殘留酶活。植酸、草酸在低濃度范圍內(nèi)(0～1 mmol/L)對(duì)POD活性抑制作用不明顯，當(dāng)濃度大于1 mmol/L時(shí)其抑制效果顯著增加。L-半胱氨酸和抗壞血酸對(duì)POD活性則有很好的抑制效果，在低濃度0.5 mmol/L時(shí)即可抑制50%的酶活性;當(dāng)濃度為10 mmol/L時(shí)，POD殘留活性分別為15.8%和4.3%。抗壞血酸對(duì)POD抑制效果較好的原因可能與其能將酶促反應(yīng)中間產(chǎn)物醌還原有關(guān)［11］;而L-半胱氨酸對(duì)POD抑制效果較好的原因可能與其能和中間產(chǎn)物醌生成穩(wěn)定的無(wú)色物質(zhì)，而阻止了黑色素的生成有關(guān)［12］。

圖6 不同抑制劑對(duì)POD活性的影響

3 結(jié)論

(1)“雞皮糙”山藥POD催化愈創(chuàng)木酚氧化反應(yīng)的最適pH為4.0，最適溫度為35℃，高溫處理可有效抑制其活性?！半u皮糙”山藥POD與不同底物結(jié)合能力的強(qiáng)弱依次為:綠原酸＞愈創(chuàng)木酚＞焦性沒(méi)食子酸＞鄰苯二酚＞沒(méi)食子酸，其中綠原酸為最適底物。

(2)Ca2+、Ba2+、Fe2+、Mg2+對(duì)“雞皮糙”山藥POD有明顯的激活作用;Mn2+、K+對(duì)POD則具有明顯的抑制作用;低濃度的Zn2+、Cu2+對(duì)POD有激活作用，而高濃度的Zn2+、Cu2+則有一定的抑制作用?？箟难帷-半胱氨酸、植酸、草酸、檸檬酸、EDTA-2Na、NaHSO3等7種抑制劑對(duì)POD活性均有一定的抑制作用，其中，抗壞血酸、L-半胱氨酸抑制效果最好，而檸檬酸、EDTA-2Na及NaHSO3的抑制效果較差。

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