王洪瑞 李軍訓(xùn) 呂明霞 宋洪寧 楊維仁* （山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 泰安 271018 泰安生力源生物工程有限公司 泰安）

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不同發(fā)酵方式處理對豆粕的影響

王洪瑞①李軍訓(xùn)②呂明霞②宋洪寧②楊維仁①*（①山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 泰安 271018 ②泰安生力源生物工程有限公司 泰安）

本研究分別選擇米曲霉、芽孢桿菌及乳酸菌菌株進(jìn)行豆粕固態(tài)發(fā)酵，以考察不同發(fā)酵方式對豆粕影響。試驗結(jié)果表明，采用組合發(fā)酵方式處理的豆粕產(chǎn)物，其各項發(fā)酵指標(biāo)均為最優(yōu)，在大豆抗原蛋白去除效果方面，米曲霉與芽孢桿菌菌株的單菌種發(fā)酵均能起到較好的大豆抗原蛋白降解效果，乳酸菌降解效果較差。

發(fā)酵 豆粕 抗原蛋白

豆粕含有豐富的蛋白質(zhì)和必需氨基酸，且營養(yǎng)成分組成合理、平衡，但其中存在多種抗?fàn)I養(yǎng)因子難以通過常規(guī)的物理或化學(xué)方法，如加熱，酸堿處理及浸提等方式徹底去除，因此，如何高效徹底地去除豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子而不破壞其營養(yǎng)價值一直是飼料研究的熱點之一(Anderson，1992；Domagalski等，1992)。大豆抗原蛋白為熱穩(wěn)定性抗?fàn)I養(yǎng)因子，包括大豆球蛋白和、、-伴球蛋白，其中最主要的是大豆球蛋白(11S)與-伴球蛋白(何學(xué)軍等，2006；Li等，1991；李成賢等，2007)。動物的免疫系統(tǒng)對大豆抗原蛋白特別敏感，可引起過敏反應(yīng)和腸粘膜損害(韓鵬飛等，2009)。采用微生物發(fā)酵法去除豆粕中大豆抗原蛋白的優(yōu)點已逐漸被證明，其相關(guān)研究已經(jīng)取得較大進(jìn)展，并已逐步實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)(萬琦等，2003；李理等，2003；張雁平，2003)。本研究采用泛酸芽孢桿菌、米曲霉及發(fā)酵乳桿菌菌株對豆粕進(jìn)行發(fā)酵，并對發(fā)酵前后豆粕中營養(yǎng)成分及抗原蛋白的變化進(jìn)行分析，探討了微生物對豆粕性質(zhì)的影響，以期獲得更為優(yōu)質(zhì)的植物蛋白飼料。

1 材料與方法

1.1 菌種

泛酸芽孢桿菌菌株FS12.21、米曲霉菌株MQ11.7及發(fā)酵乳桿菌菌株FL18均由泰安生力源生物工程有限公司技術(shù)部提供。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 菌種培養(yǎng)基 芽孢桿菌培養(yǎng)采用LB培養(yǎng)基；米曲霉培養(yǎng)采用PDA培養(yǎng)基；乳酸菌培養(yǎng)采用MRS培養(yǎng)基(固體培養(yǎng)基加2%瓊脂)

1.2.2 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基 豆粕90%，麩皮10%，料水比1:1，pH自然。

1.3 培養(yǎng)條件

芽孢桿菌及乳酸菌菌種培養(yǎng)溫度為37℃，米曲霉菌種培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)時間均為30h。物料固態(tài)發(fā)酵起始溫度均為30℃，芽孢桿菌及米曲霉發(fā)酵周期為30h，乳酸菌發(fā)酵周期為72h。

1.4 試驗方法

1.4.1 發(fā)酵豆粕樣品的制備 本試驗采用未發(fā)酵豆粕樣品做為對照樣品。發(fā)酵樣品分別采用米曲霉好氧發(fā)酵、泛酸芽孢桿菌好氧發(fā)酵、發(fā)酵乳桿菌厭氧發(fā)酵及米曲霉好氧-乳桿菌厭氧組合發(fā)酵方式進(jìn)行。（1）芽孢桿菌發(fā)酵豆粕。將滅菌后的豆粕固態(tài)培養(yǎng)基按照2%接種泛酸芽孢桿菌菌液，按照50g/瓶，分裝入500ml三角瓶，4層紗布封口，37℃培養(yǎng)30h后，50℃烘干，粉碎，過40目篩。（2）米曲霉發(fā)酵豆粕。將滅菌后的豆粕固態(tài)培養(yǎng)基按照2%接種米曲霉液體菌種，按照400g/份，分裝入篩筐培養(yǎng)，4層紗布覆蓋，30℃培養(yǎng)30h后，50℃烘干，粉碎，過40目篩。（3）乳酸菌發(fā)酵豆粕。將滅菌后的豆粕固態(tài)培養(yǎng)基按照2%接種發(fā)酵乳桿菌菌液，按照200g/瓶分裝入200ml三角瓶中壓實，塑料膜封口，37℃培養(yǎng)30h后，50℃烘干，粉碎，過40目篩。（4）米曲霉與乳酸菌組合發(fā)酵豆粕。先完成米曲霉發(fā)酵培養(yǎng)，然后將發(fā)酵物不經(jīng)烘干粉碎等處理，直接接入2%發(fā)酵乳桿菌菌液，進(jìn)行第二次接種培養(yǎng)，50℃烘干，粉碎，過40目篩。

1.4.2 測定方法 （1）理化指標(biāo)測定。樣品粗蛋白測定方法采用GB6432-94中凱氏定氮法；小肽(酸溶蛋白）含量測定采用三氯乙酸處理后再測定酸溶蛋白的方法；總酸及氨基酸態(tài)氮含量測定采用GB5009.39-2003中的甲醛值法。（2）電泳。①樣品處理：取豆粕樣品1.0000g，加入20.00ml 0.03M的Tris-HCl(pH=8.0)(包括0.01M的β-巰基乙醇)在室溫下(20℃)浸泡1h后(每10min攪動1次)，10000 rpm下離心20min，取上清40μl，加入10μl 5×樣品緩沖液，沸水浴3min后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。②電泳條件：分離膠濃度為16%，濃縮膠濃度為5%，膠孔加樣12μl。恒壓90V，到達(dá)膠界后調(diào)至100V。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品理化指標(biāo)

見附表。

附表 發(fā)酵物料指標(biāo)測定結(jié)果 (%)

項目CK米曲霉芽孢桿菌乳酸菌組合發(fā)酵 粗蛋白(DM)47.59±0.23a48.52±0.24b58.66±0.27d47.76±0.17a55.61±0.22c 酸溶蛋白(DM)2.06±0.04a8.03±0.07c21.76±0.19e3.01±0.05b20.43±0.37d 酸溶蛋白/粗蛋白4.33±0.13a16.53±0.20c37.14±0.41d6.27±0.07b36.74±0.65d 氨基酸態(tài)氮(DM)0.17±0.007a0.94±0.017c2.18±0.02d0.31±0.011b2.46±0.01e 總酸0.88±0.03a1.16±0.05b1.79±0.09c5.33±0.07d5.94±0.12e

注：DM：干物質(zhì)。相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

由發(fā)酵物理化指標(biāo)測定結(jié)果可以看出，乳酸菌對大豆蛋白的降解效果最差；而組合發(fā)酵物的ASP/CP值A(chǔ)A-N及總酸含量均為最優(yōu)，說明組合發(fā)酵方式結(jié)合了好氧發(fā)酵過程和厭氧發(fā)酵過程的優(yōu)點，對豆粕中的大豆蛋白降解效果最好。

2.2 抗原蛋白電泳結(jié)果

見附圖。

附圖 發(fā)酵前后豆粕中蛋白質(zhì)的SDS-PAGE垂直電泳

注：M：Maker；1：未發(fā)酵豆粕；2：泛酸芽孢桿菌發(fā)酵物樣品；3米曲霉發(fā)酵物樣品；4：發(fā)酵乳桿菌發(fā)酵物樣品；5：米曲霉及發(fā)酵乳桿菌組合發(fā)酵物樣品；A：7S抗原蛋白亞基；B：11S抗原蛋白酸性亞基；C：11S抗原蛋白堿性亞基。

從電泳結(jié)果可以看出，單過程的米曲霉好氧發(fā)酵、泛酸芽孢桿菌好氧發(fā)酵及發(fā)酵乳桿菌厭氧發(fā)酵均能夠起到降解豆粕中大豆抗原蛋白的效果，但發(fā)酵乳桿菌的厭氧發(fā)酵方式對大豆抗原蛋白的降解效果明顯較差。米曲霉與泛酸芽孢桿菌對大豆抗原蛋白的酶解效果存在一定差異，米曲霉對對7S抗原蛋白降解不夠徹底但對11S抗原蛋白酸性亞基降解效果較好，而泛酸芽孢桿菌則相反。此外，米曲霉與發(fā)酵乳桿菌雙過程組合發(fā)酵方式與米曲霉單過程發(fā)酵對豆粕中大豆抗原蛋白的降解效果幾乎沒有差別。

3 討論

由于在其好氧發(fā)酵過程中產(chǎn)生的大量蛋白酶在其后的厭氧發(fā)酵過程中能夠繼續(xù)降解大分子蛋白，而酶解后的大豆蛋白對乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸的過程也起到了促進(jìn)作用，將米曲霉的好氧發(fā)酵過程與發(fā)酵乳桿菌的厭氧發(fā)酵過程疊加后，發(fā)酵物的各項主要性狀均優(yōu)于單階段好氧或厭氧發(fā)酵產(chǎn)物。而發(fā)酵物中蛋白分子量分布圖譜與米曲霉單階段發(fā)酵物樣品圖譜并沒有明顯差異，一方面是因為發(fā)酵乳桿菌本身起到的降解效果較差，另一方面也說明，米曲霉與發(fā)酵乳桿菌對豆粕中大豆蛋白的酶切效果不存在明顯互補(bǔ)。

而泛酸芽孢桿菌雖然具有較高的蛋白酶活性并能夠較好地降解豆粕中的大豆蛋白，但由于芽孢桿菌類豆粕發(fā)酵物在實際生產(chǎn)中存在發(fā)酵物黏度高難處理及物料回收率低等缺點，目前尚難以實現(xiàn)其大規(guī)模應(yīng)用。

4 結(jié)論

試驗選用的泛酸芽孢桿菌菌株FS12.21、米曲霉菌株MQ11.7及發(fā)酵乳桿菌菌株FL18均能起到降解豆粕中大分子蛋白、產(chǎn)酸及去除大豆抗原蛋白的效果，但菌種間存在明顯的效率差異。乳酸菌的蛋白酶活性較差，對大豆蛋白的降解效果最差，而組合發(fā)酵方式處理的豆粕發(fā)酵方式的酶解和產(chǎn)酸效果最優(yōu)，在抗原蛋白去除效果方面，米曲霉及泛酸芽孢桿菌的好氧發(fā)酵處理效果明顯優(yōu)于發(fā)酵乳桿菌的厭氧發(fā)酵處理效果。

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（2012–09–03）

山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊建設(shè)項目資助。

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A

1007-1733(2012)10-0019-02