孫春萍 尹志明 王莉 劉玉民 （山東華牧天元農(nóng)牧股份有限公司 山東 濟南 250101）

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納豆芽孢桿菌的分離培養(yǎng)與鑒定

孫春萍 尹志明 王莉 劉玉民 （山東華牧天元農(nóng)牧股份有限公司 山東 濟南 250101）

根據(jù)納豆芽孢桿菌耐鹽、耐溫、耐pH的能力及C/H值大小，從豆豉中分離出幾株淀粉水解能力較強的菌株，通過初篩、復篩選出一株最優(yōu)菌株，通過革蘭氏染色、細胞形態(tài)、菌落形態(tài)觀察和生理生化反應及大豆發(fā)酵試驗，確定該菌株為枯草芽孢桿菌的一個變種，即納豆芽孢桿菌

納豆芽孢桿菌 分離 鑒定 生化試驗

納豆(Natto)是日本的一種傳統(tǒng)食品，由納豆菌(B acillus natto)在一定溫度、濕度下發(fā)酵蒸煮大豆制備而成。納豆含有豐富的蛋白質(zhì)、氨基酸和多種人體所需的生物活性物質(zhì)，如納豆激酶、超氧化物歧化酶(SOD)、吡啶二羧酸等，其中的納豆激酶(nattokinase，NK)是納豆發(fā)酵過程中由納豆菌產(chǎn)生的一種具有纖溶活性的絲氨酸蛋白酶，具有良好的溶解血栓能力[1-2]。納豆具有多種醫(yī)療保健功能，近年來大量的研究證實常食納豆不僅能有效預防和治療心腦血管疾病，而且還具有強身健體、防癌抗癌、調(diào)整腸功能、延緩衰老等功效[3-4]，因此被稱為21世紀的“超級中藥”，在日本享有“蔬菜干酪”的美譽[5-6]。從納豆中篩選出的納豆枯草芽孢桿菌(B acillus subtilisnatto)，經(jīng)菌種鑒定屬于芽孢桿菌屬枯草芽孢菌，廣泛應用于生物制藥、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)等行業(yè)，是人類的重要“益生菌”[7]。本試驗主要對從納豆中分離得到的納豆芽孢桿菌的細胞、菌落形態(tài)及生理特性進行研究，以明確這些菌株的種類，為后續(xù)試驗提供菌種材料。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 豆豉樣品數(shù)份 購自農(nóng)貿(mào)市場。

1.1.2 抗生素藥敏片 購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.3 納豆芽孢桿菌C5 山東農(nóng)業(yè)大學大學食品微生物實驗室贈予。納豆芽孢桿菌CICC:10023購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.4 培養(yǎng)基 淀粉培養(yǎng)基，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基購自青島海博生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 納豆芽孢桿菌的分離 稱取豆豉10g置于裝有90ml無菌生理鹽水的500ml三角瓶中浸泡72h，間隔20min振蕩1次。72h后用80~90℃水浴加熱10~15min，冷卻，梯度稀釋后，取0.2ml加入無菌平皿，傾入淀粉培養(yǎng)基，立即搖勻。37℃倒置培養(yǎng)24~48h。挑取淀粉水解圈直徑與菌落直徑比值(C/H的值)較大的菌落接入牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基，培養(yǎng)備用。

1.2.2 納豆芽孢桿菌純化 將上述選定的菌株在淀粉培養(yǎng)基上進行平板劃線分離純化，重復操作3~4次，直至獲得單一菌株，轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，4℃冰箱保存?zhèn)溆?。根?jù)革蘭氏染色、細胞形態(tài)及菌落特征進行納豆芽孢桿菌初步鑒定。

1.2.3 菌株的初選 納豆芽孢桿菌具有一定的耐鹽、耐pH及耐熱性，為了從分離的菌株中篩選出符合需要的優(yōu)勢菌株，選擇了含鹽量7%、pH5.0、溫度55℃和淀粉水解圈直徑與菌落直徑比值(C/H)四項指標進行初篩，獲得兩個納豆芽孢桿菌單菌株B2，B15，并進行菌株鑒定確認。（1）耐鹽試驗：取含70g/LNaCl牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)各50ml于150ml三角瓶中，滅菌0.1MPa/20min，接種納豆芽孢桿菌菌液0.2ml，于37℃、120r/min培養(yǎng)24h。以含5g/L NaCl的培養(yǎng)基為對照，測定△A660nm/ACK660nm。（2）耐溫試驗：取牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基各50ml于150ml三角瓶中，滅菌0.1MPa/20min，接種活化菌液0.2ml，于55℃、120min，培養(yǎng)24h。以培養(yǎng)溫度37℃為對照，測定△A660nm/ACK660nm。（3）耐pH試驗：取牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(pH5.1)50ml于150ml三角瓶中，滅菌0.1MPa/ 20min，接種活化菌液0.2ml，于37℃、120r/min培養(yǎng)24h，以培養(yǎng)基pH7.2為對照，測定△A660nm/ACK 660nm。（4）C/H測定：將上述各活化菌液無菌10倍遞增稀釋，分別取后3個稀釋度菌液各0.2ml于無菌平皿，每一稀釋度做2個平行。將放置在45℃水浴鍋中的的淀粉培養(yǎng)基傾入各平皿中，立即搖勻，待凝固后37℃倒置培養(yǎng)24~48h，測定淀粉水解圈直徑與菌落直徑比值(C/H)。

1.2.4 優(yōu)勢菌株的復選 （1）菌株對溫度的耐受性：比較分離篩選所得菌株與B2、B15與實驗室保藏的納豆芽孢桿菌C2、CICC對溫度的耐受性，挑取各菌株2環(huán)斜面菌種接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，于37℃、120r/min振蕩培養(yǎng)16h，分別取培養(yǎng)液1ml稀釋至一定的倍數(shù)，將后兩個稀釋度的菌液分別置93℃和98℃水浴5、10、15、20min，流水冷卻，以未經(jīng)水浴的菌株作為對照，采用平板計數(shù)法計算水浴后的存活率。存活率=(水浴處理存活的平均菌數(shù)/室溫存活的平均菌數(shù))×100%。（2）菌株對pH的耐受性：配制不同的pH緩沖液，緩沖液分2份，一份用于測定滅菌后的pH。其中A液為0.2mol/L的磷酸氫二鈉，B液為0.1mol/L的檸檬酸溶液，配制方法見表1。取各菌株培養(yǎng)液1ml加入到各滅菌緩沖液中處理30min，其稀釋至一定的倍數(shù)，涂布平板計數(shù)，計算相對存活率。相對存活率={pH處理后的每實驗組存活的平均菌數(shù)/Max(pH處理后的每實驗組存活的平均菌數(shù))}×100%。（3）菌株對抗生素耐受性：取各菌株培養(yǎng)液適當稀釋至菌數(shù)在106~107個/ml，分別取0.2ml涂布平板，用無菌鑷子取圓形抗生素藥敏片貼在平板表面，靜置2h后倒置培養(yǎng)24h，測定抑菌圈的直徑，以此判斷各菌株對各抗生素耐受能力性。

表1 不同pH緩沖液的配制

1.2.5 菌株的鑒定 根據(jù)《伯杰細菌鑒定手冊》(第八版)所述芽孢桿菌屬典型菌體形態(tài)、菌落形態(tài)和生理生化特性，對所獲得菌株進行鑒定。

2 結(jié)果

2.1 乳酸桿菌分離和菌落形態(tài)

在淀粉培養(yǎng)基上根據(jù)C/H值的大小挑取了15個菌株并分別命名為B1~B15，并對菌株進行純化，選擇了其中B2、B4、B7、B11、B15和實驗室保藏的菌種C5、CICC共7個菌株進行后續(xù)實驗。通過菌落形態(tài)觀察、革蘭氏染色和鏡檢發(fā)現(xiàn)上述7個菌株革蘭氏染色均呈陽性、菌體桿狀，芽孢柱狀或橢圓狀、中生或近中生且不膨大，菌落乳白色且不透明、中央凸起有皺褶、菌落邊緣不整齊，用牙簽挑取時可形成很長的拉絲。根據(jù)以上特征可初步確定所分離的菌株為納豆芽孢桿菌。

2.2 納豆芽孢桿菌的初篩

表2 菌株初篩結(jié)果

根據(jù)益生菌株在實際應用中所遇到的問題，如在高溫處理過程中必須保證一定的存活率，在進入人體或動物體內(nèi)的時候能經(jīng)受住胃酸的作用，最后在小腸能夠定植并產(chǎn)生較多的代謝物質(zhì)等，故將菌株對溫度、pH的耐受能力和產(chǎn)淀粉酶能力(即C/H值)作為篩選的主要考慮因素，同時將菌株耐鹽的強弱作為篩選的一個輔助因素。在3個主要因素中，如果有一個因素不符合要求，就將被排除。

從表2可以看出，各菌株對溫度的耐受能力存在較大的差異，對溫度耐受能力最強的菌株CICC達到了48%，將對溫度的耐受能力在20%以下的菌株B7、B11予以淘汰；符合要求的菌株進行pH耐受能力的比較，各菌株對pH的耐受能力都比較強，再排除C/H的值較小的菌株C5，去掉耐鹽能力相對較差的菌株B4，選擇B2、B15和CICC菌株作為后續(xù)試驗菌株。

2.3 納豆芽孢桿菌的復篩

2.3.1 菌株對溫度的耐受性

2.3.2 菌株對pH的耐受性從表3可知，3個菌株對pH的耐受能力B15>B2>CICC。

表3 菌株對pH的耐受性

2.4 菌株對抗生素耐受性

從表4可知各菌株對抗生素的耐受能力都較弱，但存在一定的差異。各菌株對鏈霉素耐受能力最強，而對頭孢噻吩類抗生素耐受能力最差，對其他抗生素耐受能力則介于這二者之間。此外，各個菌株對同一種抗生素的耐受能力沒有明顯差異。

表4 菌株對抗生素耐受性(抑菌圈直徑) (mm)

綜合上述結(jié)論，最終選擇耐受能力都比較強的B2菌株。

2.5 菌株鑒定

以枯草芽孢桿菌為標準對照，進行生理生化試驗結(jié)果見表5，通過上述的生理生化反應和前面的革蘭氏染色、細胞形態(tài)及菌落形態(tài)觀察，可以確定B2菌株為枯草芽孢桿菌。將分離的B2菌株進行大豆發(fā)酵實驗，2d后觀察到在大豆表面形成白色粘稠狀物質(zhì)，用牙簽挑取時可形成較長的拉絲，由此判斷該菌株為枯草芽孢桿菌的一個變種，即納豆芽孢桿菌。

表5 B2的生理生化試驗

3 結(jié)論

采用涂布平板、劃線分離等微生物分離純化技術從我國傳統(tǒng)食品豆豉中分離出幾株淀粉水解能力較強的菌株，并通過比較分離的菌株與本實驗室保存的納豆芽孢桿菌的耐鹽、耐溫、耐pH的能力及C/H值大小進行初篩，復篩比較了分離菌和實驗室保存的納豆芽孢桿菌的耐受性，從中選出一株最優(yōu)菌株B2。通過革蘭氏染色、細胞形態(tài)、菌落形態(tài)觀察和生理生化反應及大豆發(fā)酵實驗，確定B2菌株為枯草芽孢桿菌的一個變種，即納豆芽孢桿菌。

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（2012–09–19）

山東省技術創(chuàng)新項目(201131901022)、山東省技術創(chuàng)新項目(201121901001)、濟南市自主創(chuàng)新計劃(201101070)、濟南市高新區(qū)科技發(fā)展計劃項目(濟高管字[2011]222號)）

S852.61+6

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1007-1733(2012)10-0014-03