張恒 李文鵬 吳慶海 薛喜娟 周文中 王海兵 （山東信得科技股份有限公司 山東 諸城 262200）

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雞轉(zhuǎn)移因子(信必妥)活性檢測

張恒 李文鵬 吳慶海 薛喜娟 周文中 王海兵 （山東信得科技股份有限公司 山東 諸城 262200）

本研究通過抗體效價提升、淋巴細胞增殖和脫E受體法三個試驗驗證了轉(zhuǎn)移因子的部分活性。轉(zhuǎn)移因子是具有免疫活性的T淋巴細胞所釋放的一類帶有致敏淋巴細胞的特異性免疫信息，可透析小分子物質(zhì)，能夠轉(zhuǎn)移和擴大細胞免疫力。

轉(zhuǎn)移因子 雞 信必妥 抗體

轉(zhuǎn)移因子(transfer factor)是一種不耐熱、可透析的低分子肽與核苷酸復合物，具有傳遞免疫信息、激發(fā)免疫細胞活性、調(diào)節(jié)免疫功能、增強機體非特異性細胞免疫功能等作用，被譽為T細胞活性的觸發(fā)劑，細胞免疫的增強劑和調(diào)節(jié)劑[1]。由于其有分子量小、無毒性、無抗原性、不引起過敏反應和不產(chǎn)生對抗抗體且可超越種系界限應用等優(yōu)點，因而是一種具有廣泛應用前景的免疫增強劑。本研究從體內(nèi)和體外兩個方面檢測了雞轉(zhuǎn)移因子活性，為轉(zhuǎn)移因子治療疾病提供了合理解釋，同時為更深一步的轉(zhuǎn)移因子研究打下了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 SPF雛雞購自濟南斯派福禽業(yè)科技有限公司，飼養(yǎng)于負壓隔離器中，自由采食；綿羊血采于某養(yǎng)殖戶；豬胸腺采于諸城某屠宰場。

1.1.2 主要試劑 信必妥口服液(主要成分是雞脾臟轉(zhuǎn)移因子)產(chǎn)自山東信得科技有限公司。重組禽流感病毒H5亞型二價滅活疫苗(H5N1，Re-5株+ Re-4株)購自遼寧益康生物股份有限公司。滅活胎牛血清及淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物制品科技有限公司；RPMI Medium 1640購自GIBCO公司；刀豆蛋白A(Con A)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、姬姆薩染料購自Sigma試劑公司。磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鉀、氯化鈉、葡萄糖、碳酸氫鈉、甲醇等生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 脫E受體法測定轉(zhuǎn)移因子活性 （1）取新鮮豬胸腺，淋巴細胞分離液分離T淋巴細胞后，加適量Hank’s液，混勻，45℃恒溫水浴保溫30min(每隔5min振搖一次)。以1500r/min離心3~5min，棄上清后，再加適量Hank’s液，混勻后，置45℃恒溫水浴保溫30min，離心棄上清液。用Hank’s液洗滌3次，適當稀釋并計數(shù)，使最終濃度為5′106個/ml。將綿羊紅細胞濃度調(diào)整為5′107個/ml；轉(zhuǎn)移因子(信必妥)，用Hank’s液配制成每1ml中含1mg的溶液。（2）取小試管6支，3支各加Hank’s液0.1ml作對照管，另3支各加待檢樣品溶液0.1ml作測定管，每管中各加脫E受體胸腺T細胞懸液0.2ml，37℃保溫1h后，加綿羊紅血球懸液0.2ml搖勻，以500r/min離心3min，放入4℃過夜，棄去上清液，每管中各加固定液一滴，輕輕搖勻，靜置10min，加染色液2滴并搖勻，靜置15min后計數(shù)，統(tǒng)計其中的E玫瑰花結(jié)形成的細胞數(shù)(結(jié)合3個以上綿羊紅細胞)，求得結(jié)花百分率，取平均值。（3）樣品活力=供試品測定管E玫瑰花結(jié)百分率-對照管E玫瑰花結(jié)百分率

1.2.2 轉(zhuǎn)移因子提高禽流感油苗H5N1抗體效價 60日齡SPF雛雞30只分為3組，試驗組10只，口服轉(zhuǎn)移因子(信必妥口服液)1ml/只連續(xù)飼喂2d后，每只雞注射重組禽流感病毒H5亞型二價滅活疫苗1ml；對照組10只，每只雞注射重組禽流感病毒H5亞型二價滅活疫苗1ml；空白組10只，不免疫不使用信必妥。免疫14d后，采取血液分離血清備用，采用HI實驗測定兩種毒株Re-5株和Re-4株的抗體效價。

1.2.3 轉(zhuǎn)移因子提高外周血T淋巴細胞增殖 30日齡SPF雛雞20只分為2組，試驗組10只，口服轉(zhuǎn)移因子(信必妥口服液)1ml/只連續(xù)飼喂2d；對照組正常飼養(yǎng)，不做任何處理。7d后，分離外周血，測定每一只雞T淋巴細胞增殖率(MTT)[2]。使用SPASS統(tǒng)計軟件，分析試驗組與對照組外周血T淋巴細胞轉(zhuǎn)化率差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)移因子的生物活性

本試驗系根據(jù)轉(zhuǎn)移因子可使脫E受體后的胸腺T細胞恢復其受體功能，從而反映轉(zhuǎn)移因子的生物活性。實驗結(jié)果見圖1，最后測得樣品的活性為18.2%，按T細胞活性測定法-脫E受體法測定，供試品管的E玫瑰花結(jié)百分率與對照管的E玫瑰花結(jié)百分率之差應不低于10.0%，說明轉(zhuǎn)移因子具有很好的生物活性。

圖1 E玫瑰花環(huán)試驗結(jié)果

A：試驗組(100x)；B:對照組(100x)；C：試驗組(400x)

2.2 抗體效價

通過血凝抑制試驗HI測定每只雞的抗體效價，使用以下方法計算每組平均抗體效價，平均抗體效價=(Log2n1+Log2n2+Log2n3+……+Log2n10)/10，各組平均抗體效價見表1，試驗組Re-4抗體效價與對照組相比高出2個滴度，Re-5抗體效價高出0.6個滴度，采用SPSS軟件分析差異顯著，可以看出轉(zhuǎn)移因子可以顯著提高疫苗的免疫效果。

表1 抗體效價測定 (log2)

注：*代表差異顯著(P<0.05)

2.3 外周血T淋巴細胞增殖試驗

采用SPSS軟件分析MTT試驗結(jié)果，試驗組與對照組相比較吸光度數(shù)值差異顯著，證明使用轉(zhuǎn)移因子可以提高外周血T淋巴細胞活性。

表2 MTT試驗數(shù)值的分析結(jié)果

注：*代表差異顯著(P<0.05)。

3 討論

轉(zhuǎn)移因子作為一種免疫調(diào)節(jié)劑，其直接的作用機制目前不十分清楚，但理論已證實，轉(zhuǎn)移因子能傳遞抗原特異性物質(zhì)，作用于T細胞、巨噬細胞，介導免疫反應的發(fā)生，促進多種細胞因子在體內(nèi)的生成，作用于免疫系統(tǒng)的多個環(huán)節(jié)，以增強受體的免疫功能。

圖2 MTT實驗數(shù)值柱形圖

本研究從體內(nèi)和體外兩個方面驗證了轉(zhuǎn)移因子的活性。給SPF雛雞注射后可以顯著提高免疫疫苗的抗體滴度，說明轉(zhuǎn)移因子可以增強體液免疫反應，增強疫苗的保護效果。淋巴細胞增殖試驗結(jié)果表明轉(zhuǎn)移因子可以顯著促進外周血T淋巴細胞增殖；同時轉(zhuǎn)移因子可以體外作用脫E受體的T淋巴細胞使其恢復結(jié)合綿羊紅細胞活性，說明轉(zhuǎn)移因子可以增強細胞免疫反應，增強機體的抗病毒能力。本研究結(jié)果與江青艷等人的研究一致，江青艷等[3]研究發(fā)現(xiàn)，雞轉(zhuǎn)移因子在提高受體細胞免疫功能的同時，還能使受體的體液免疫功能得到加強。

轉(zhuǎn)移因子在家禽疾病防治中應用較廣，且效果顯著。對很多細菌性、病毒性、原蟲性和免疫缺陷性疾病有明顯而獨特的療效。臨床證明轉(zhuǎn)移因子在治療雞傳染性法氏囊病、禽流感、雞傳染性法氏囊病和雞神經(jīng)型馬立克氏病等疾病具有較好的治療效果[3-6]。

因此，轉(zhuǎn)移因子在治療雞疾病，尤其是病毒性疾病，具有很好的應用前景和發(fā)展?jié)摿Α?/p>

[1] 孫衛(wèi)民, 王惠琴. 細胞因子研究方法學[M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2001: 762~763.

[2] 張恒. 雞堆型艾美爾球蟲免疫增強型核酸疫苗構(gòu)建及其免疫效應[D]. 哈爾濱: 東北農(nóng)業(yè)大學, 2011.

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[5] 黃建文, 姜艷芬, 何維明. 轉(zhuǎn)移因子對人工感染禽流感病毒雛雞作用的研究[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)大學學報, 2002(2): 170~173.

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（2012–06–14）

S859.83

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1007-1733(2012)10-0008-02