陳 輝, 鄭彩霞， 楊玉峰， 林婷婷， 袁 棟， 徐 峰

(臺(tái)州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院,浙江 臺(tái)州 318000)

均四嗪類(lèi)化合物具有較多生理活性，如抗炎[1]、鎮(zhèn)痛[2]、抗病毒[3]及抗菌[4]。均四嗪的衍生物一般分為三類(lèi)，即1,4-二氫，1,2-二氫和1,6-二氫均四嗪。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)二氫均四嗪類(lèi)化合物具有抗癌活性而引起人們關(guān)注。胡惟孝等[5]發(fā)現(xiàn)3，6-二苯基-1,4-二氫-1，4-二甲酰胺均四嗪類(lèi)化合物具有很強(qiáng)的抗癌活性，其中N，N′-二間甲基苯胺-3，6-二甲基-1，4-二氫均四嗪-1，4-二甲酰胺對(duì)小鼠白血病細(xì)胞P-388,人實(shí)體瘤細(xì)胞肝癌BEL-7402，乳腺癌MCF-7和肺腺癌A-549均有較強(qiáng)的增殖生長(zhǎng)抑制作用；饒國(guó)武等[6]發(fā)現(xiàn)3，6-二苯基-1，2-二氫均四嗪類(lèi)化合物具有較強(qiáng)的抗癌活性,其中1-氯乙酸?；?3，6-苯基-1，2-二氫均四嗪對(duì)P-388和A-549具有較強(qiáng)的抗癌能力。但至今為止，1，6-二氫均四嗪衍生物的抗癌活性研究還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

Scheme1

本文以3-(3,5-二甲基吡唑-1-基)-6-肼基均四嗪(1)和芳醛(2a～2f)為原料，經(jīng)Schiff堿縮合和環(huán)合反應(yīng)合成了6個(gè)新型的6-芳基-3-(3,5-二甲基吡唑-1-基)[1,2,4]三唑[4,3-b]均四嗪(4a～4f， Scheme 1)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR， MS， IR和元素分析表征。以順鉑為對(duì)照，采用四氮唑鹽還原法(MTT法)測(cè)試了體外4a～4f對(duì)人白血病細(xì)胞株HL-60， A-549， MCF-7和人子宮頸癌細(xì)胞株Hela的抗癌活性。結(jié)果表明，4a～4f均具有較強(qiáng)的體外抗癌活性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

XRC-1型熔點(diǎn)儀(溫度未經(jīng)校正)；Brucker AC400(400 MHz)型核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))；Nicolex FI-IR-170型紅外光譜儀(KBr壓片);HP 5989A型質(zhì)譜儀。

HL-60， A-549， MCF-7和Hela,中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；DMEM培養(yǎng)基，Gibco； MTT， Sigma(上海實(shí)生細(xì)胞生物技術(shù)有限公司分裝)；胎牛血清，青霉素-鏈霉素，EDTA-胰酶消化液，Gibco；順鉑，齊魯制藥有限公司產(chǎn)品(產(chǎn)品批號(hào)1010011DC)；其余所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1) 3a～3f的合成(以3a為例)

在反應(yīng)瓶中加入1 1.0 g(4.85 mmol)的無(wú)水乙醇(20 mL)溶液，攪拌下于室溫滴加苯甲醛(2a)0．5 g(4.85 mmol)的無(wú)水乙醇(10 mL)溶液，滴畢，反應(yīng)至終點(diǎn)(TLC跟蹤，展開(kāi)劑：乙酸乙酯)。抽濾，濾餅干燥得磚紅色固體1-苯基亞甲基-2-[6-(3,5-二甲基-1H-吡唑-1-基)-1,2,4,5-四嗪-3-基]肼(3a),產(chǎn)率，58.0%， m.p.198 ℃～200 ℃；1H NMRδ: 12.59(s, 1H), 8.37(s, 1H), 7.78(d,J=6.6 Hz， 2H), 7.44～7.49(m, 3H), 6.24(s, 1H), 2.47(s, 3H), 2.25(s, 3H)； IRν： 3 217, 3 053, 1 606, 1 485, 1 419 cm-1； MSm/z： 295{[M+H]+}。

用類(lèi)似的方法合成3b～3f,其表征數(shù)據(jù)[7]與Scheme 1預(yù)期吻合。

(2)4a～4f的合成(以4a為例)

在反應(yīng)瓶中加入3a1．5 g(4．5 mmol)和氯仿30 mL，攪拌下加入四醋酸鉛2.5 g(5.7 mmol)的氯仿(10 mL)溶液，回流反應(yīng)30 min(溶液變成棕黃色)。冷卻至室溫，減壓抽除溶劑，加入無(wú)水乙醇，析出大量固體，冷卻至0 ℃，抽濾，濾餅干燥后用無(wú)水乙醇重結(jié)晶得深黃色固體3-(3,5-二甲基-1H-吡唑-1-基)-6-苯基-[1,2,4]三唑[4,3-b]均四嗪(4a)。

用類(lèi)似的方法合成黃色固體4b～4d, 4f和棕黃色固體4e。

1．3 抗癌活性測(cè)試

以順鉑為對(duì)照，采用MTT法測(cè)定4a～4f對(duì)HL-60， A549， MCF-7和Hela的體外抗癌活性。順鉑和4(1 mg)用DMSO(20 μL)溶解；取2 μL用1 000 μL培養(yǎng)液稀釋，使?jié)舛?c)為100 μg·mL-1,再用培養(yǎng)液連續(xù)稀釋至使用濃度;每1 000 mL培養(yǎng)基中含80萬(wàn)單位青霉素，1.0 g鏈霉素,10%滅活胎牛血清;將腫瘤細(xì)胞接種于培養(yǎng)基中,置37 ℃, 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 d～5 d傳代。

將癌細(xì)胞用EDTA-胰酶消化液消化，并用培養(yǎng)基稀釋成1.0×105·mL-1,加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100 μL，置37 ℃， 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種24 h 后，傾去培養(yǎng)基，加入用培養(yǎng)基稀釋的樣品，每孔 200 μL，每個(gè)濃度加3孔，置37 ℃， 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后在細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入5 mg·mL-1的MTT，每孔10 μL，置37 ℃孵育3 h;加入DMSO,每孔150 μL,用振蕩器振蕩，使甲臢完全溶解，用酶標(biāo)儀于490 nm處測(cè)OD值,計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率{抑制率/%=[1-(OD藥物-OD空白)/(OD對(duì)照-OD空白)]×100%},根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率，以直線回歸方法計(jì)算IC50值。以同樣條件用不含樣品，含同樣濃度DMSO的培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞作為對(duì)照，計(jì)算樣品對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的半數(shù)致死濃度(IC50)。

表1 4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和MS數(shù)據(jù)Table 1 Experimental results and MS data of 4

表2 4的1H NMR和IR數(shù)據(jù)Table 2 1H NMR and IR data of 4

2 結(jié)果與討論

2．1 合成

合成4時(shí)，縮合劑可用四醋酸鉛，也可用甲磺酸和對(duì)甲苯磺酸等磺酸類(lèi)催化劑，效果均較好。合成4的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和表征數(shù)據(jù)分別見(jiàn)表1和表2。從表1可見(jiàn)，當(dāng)苯環(huán)上的取代基為吸電子基(2b～2d,2f)時(shí)，產(chǎn)物的顏色為亮黃色，且收率較高(56.5%～73.2%)；當(dāng)苯環(huán)上的取代基為電子基(2e)或無(wú)取代基(2a)時(shí)，產(chǎn)物的顏色相對(duì)較深，收率也較低(31.3%～40.6%)， 4e還極易吸潮發(fā)黏。

2．2 抗癌活性

4的抗癌活性結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可見(jiàn)，4a～4f對(duì)四種癌細(xì)胞均具有較強(qiáng)的抑制活性，其中4a對(duì)HL-60的活性(IC50=3.54 μg·mL-1)約為順鉑(IC50=6.65 μg·mL-1)的2倍； 4b抑制A-549的活性(IC50=2.70 μg·mL-1)與順鉑(IC50=2.62 μg·mL-1)相當(dāng)；在抑制MCF-7時(shí)， 4a～4f的活性(IC50=1.09 μg·mL-1～6.36 μg·mL-1)明顯好于或相當(dāng)于順鉑(IC50=6.38 μg·mL-1)；另外，4a～4f雖然顯示了較好的抑制Hela的活性(IC50=1.05 μg·mL-1～6.91 μg·mL-1)，但比順鉑(IC50=0.58 μg·mL-1)略顯遜色。

表3 4的抗癌活性Table 3 Anti-cancer activities of 4

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[7] 3b:絳紅色固體,產(chǎn)率42.1%， m.p.204 ℃～207 ℃；1H NMRδ: 12.60(s, 1H), 8.36(s, 1H), 7.84(q,J=8.8 Hz, 5.6 Hz， 2H), 7.32(t,J=8.8 Hz， 2H), 6.24(s, 1H), 2.50(s, 3H), 2.47(s, 3H)； IRν： 3 222, 3 036, 1 606, 1 572, 1 423 cm-1； MSm/z： 313({[M+H]+}． 3c：桔紅色固體,產(chǎn)率84.3%， m.p.229 ℃～230 ℃；1H NMRδ: 12.82(s, 1H), 8.69(s, 1H), 8.07(d,J=8.6 Hz， 1H), 7.75(s, 1H), 7.55(d,J=8.6 Hz， 1H), 6.24(s, 1H), 2.50(s, 3H), 2.25(s, 3H)； IRν： 3 222, 3 065, 1 573, 1 485, 1 421 cm-1； MSm/z： 363{[M+H]+}. 3d：鮮紅色固體，產(chǎn)率98.0%， m.p.220 ℃～222 ℃；1H NMRδ: 12.91(s, 1H), 8.45(s, 1H), 8.32(d,J=8.8 Hz， 2H), 8.04(d,J=8.8 Hz， 2H), 6.26(s, 1H), 2.50(s, 3H), 2.26(s, 3H)； IRν： 3 257, 3 022, 1 523, 1 485, 1 428 cm-1； MSm/z： 340{[M+H]+}. 3e:暗紅色固體,產(chǎn)率83.2%, m.p.198 ℃～200 ℃；1H NMRδ: 12.45(s, 1H), 8.31(s, 1H), 7.72(d,J=8.8 Hz， 2H), 7.04(d,J=8.8 Hz， 2H), 6.23(s, 1H), 3.82(s, 3H), 2.45(s, 3H), 2.25(s, 3H)； IRν： 3 230, 3 062, 1 513, 1 488, 1 424 cm-1； MSm/z： 325{[M+H]+}． 3f:桔黃色固體,產(chǎn)率90.4%. m.p.215 ℃～217 ℃；1H NMRδ: 12.77(s, 1H), 8.76(s, 1H), 8.07(d,J=9.6 Hz， 1H), 7.56(s,J=9.6 Hz， 1H), 7.46(m, 2H), 6.25(s, 1H), 2.51(s, 3H), 2.25(s, 3H)； IRν： 3 210, 3 055, 1 540, 1 458, 1 420 cm-1； MSm/z： 328{[M+H]+}.