杜永成，王玉波，范文婷，蓋志佳，于敦爽，谷 維，張俐俐，馬鳳鳴*

(1東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030;2黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物營(yíng)養(yǎng)實(shí)用技術(shù)研究所，黑龍江哈爾濱150086)

NO3－在植物體內(nèi)先還原成NH4+，最后才能轉(zhuǎn)化為植物體可直接利用的有機(jī)物谷氨酰胺［1］。目前已知，由NO3－還原成NH4+這一代謝過(guò)程需要由硝酸還原酶(nitrate reductase，NR)和亞硝酸還原酶(nitrite reductase，NiR)參與完成。而NR及NiR與光合都有著極為密切的聯(lián)系，NR是一種光誘導(dǎo)酶，并且硝酸還原反應(yīng)的進(jìn)行需要NADH提供還原力［2－3］，而 NADH 正是由光反應(yīng)產(chǎn)生的 NADPH 轉(zhuǎn)換而來(lái);NiR則是直接需要光反應(yīng)中產(chǎn)生的鐵氧還蛋白(Fd)才能進(jìn)行還原反應(yīng)［4］，將NO2－還原成NH4+。前人對(duì) NR 進(jìn)行了大量細(xì)致的研究［5－11］，但是對(duì)NiR的研究鮮有報(bào)道。

由于NR在植物體內(nèi)的生成受硝態(tài)氮的誘導(dǎo)，而NR與NiR在氮代謝中以偶聯(lián)調(diào)節(jié)的形式對(duì)氮代謝進(jìn)行調(diào)節(jié)，因此本試驗(yàn)以甜菜品種KWS0143為材料，通過(guò)施用不同硝態(tài)氮水平對(duì)甜菜體內(nèi)NR活力、NiR活力、葉綠素總含量以及生育期內(nèi)光合速率的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行研究，對(duì)硝態(tài)氮與NR活力、NiR活力、葉綠素總含量及光合速率間關(guān)系進(jìn)行分析，從而進(jìn)一步探索甜菜的氮代謝過(guò)程。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2009～2010年在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)科研實(shí)習(xí)基地進(jìn)行，土壤類型為黑土，耕層土壤基礎(chǔ)肥力為:有機(jī)質(zhì)含量26.4 g/kg、全氮1.55 g/kg、全磷0.348 g/kg、緩效鉀888 mg/kg、堿解氮189.2 mg/kg、速效磷28.9 mg/kg、速效鉀272 mg/kg、pH 6.47。

試驗(yàn)設(shè) 0、60、120、180 kg/hm24個(gè)氮素水平，分別以N0、N60、N120、N180表示。供試肥料為硝酸鈣(含N 13%)，以基肥的形式一次施用。采用框栽栽培方式(框深0.5 m)，框區(qū)內(nèi)規(guī)格為行長(zhǎng)8 m、行距0.7 m、株距0.23 m，5行區(qū)，面積為28 m2。5次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列。

供試甜菜品種為KWS0143。試驗(yàn)于4月20日人工播種，10月2日收獲，管理同大田。

1.2 測(cè)定指標(biāo)及方法

從長(zhǎng)出第6片真葉時(shí)(6月6日)開始取樣，每隔15 d左右在晴朗天氣的上午8:00～10:00，每處理隨機(jī)取三株，對(duì)其完全展開的功能葉片進(jìn)行光合速率的測(cè)定，然后將植株整株出土放入冷藏箱帶回實(shí)驗(yàn)室。葉片部分取樣方法為自內(nèi)向外選取完全展開的功能葉數(shù)片，去葉脈剪碎混勻用以測(cè)定葉綠素含量及酶活性。塊根部分取樣方法為將塊根切成小片混勻用以測(cè)定酶活性。

光合速率的測(cè)定:采用Photosynthesis System CI－310(CID.inc U.S.A)。儀器初始設(shè)定為 Open System(開放葉室)，Single(單次測(cè)量)，葉室面積6.5 cm2，設(shè)定流量為0.4 L/min，反應(yīng)時(shí)間10 s。于光合穩(wěn)定時(shí)進(jìn)行3次測(cè)定，取平均值。每株甜菜測(cè)定2片葉，每處理測(cè)定3株，取平均值。

葉綠素(a+b)總含量的測(cè)定按郝再彬等［12］的方法。加80%丙酮提取，于波長(zhǎng)663 nm、645 nm下測(cè)定光密度值并代入公式計(jì)算。葉綠素總含量Ct=8.05 A663+20.29 A645，其中，Ct為葉綠素濃度，以μg/mL表示。

硝酸還原酶(NR)活性的測(cè)定:參照于海彬等［13］的方法，分別測(cè)定內(nèi)源與外源基質(zhì)條件下的甜菜葉片NR活力，即enNRA與exNRA。NR活性用NO2－μg/(g·h)，F(xiàn)W表示。

亞硝酸還原酶(NiR)活性的測(cè)定:參照Rajasekhar等［14］和 Kenjirou 等［15］的方法，略有改動(dòng)。NiR活性用NO2－μg/(g·h)，F(xiàn)W表示。

含糖率的測(cè)定:將取樣器由根頸和根頭部交界處依45°角方向插入根內(nèi)取樣，樣品置于壓榨鉗中壓出汁液，用折光法進(jìn)行測(cè)定［16］。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用DPS 7.05系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 光合速率、葉綠素總含量、NR和NiR活性的動(dòng)態(tài)變化

2.1.1 甜菜葉片光合速率的動(dòng)態(tài)變化 甜菜葉片光合速率呈單峰曲線變化，峰值在塊根增長(zhǎng)初期(8月7日)。不同處理的葉片光合速率變化趨勢(shì)基本一致。N0處理的光合速率在各取樣時(shí)期均最低。在同一取樣時(shí)期，4個(gè)處理表現(xiàn)為N180≈N120＞N60＞N0(圖1)。

2.1.2 甜菜葉片中葉綠素總含量的動(dòng)態(tài)變化 在幼苗期，甜菜葉片葉綠素總含量較高，隨后下降，至葉叢形成初期(7月8日)升至最高水平其后緩慢下降(圖2)。這可能是因?yàn)橛酌缙?6月6日)甜菜葉片新生，所以有較高的葉綠素含量;在葉叢形成期，葉片形態(tài)建成，以增大單位面積光合能力為主，所以葉綠素含量最高;甜菜葉片的旺盛生長(zhǎng)(7月)結(jié)束后，生長(zhǎng)中心逐漸下移，同時(shí)葉片開始出現(xiàn)衰老，新生葉片少于衰老葉片，導(dǎo)致葉綠素含量逐漸下降。不同處理的葉片葉綠素總含量變化趨勢(shì)基本一致。在同一取樣時(shí)期，各處理間葉綠素含量差異較大，其中N0處理的含量在整個(gè)取樣時(shí)期均最低。

2.1.3 甜菜葉片中NR活性的動(dòng)態(tài)變化 NR活性在整個(gè)生育期間呈雙峰曲線變化(圖3)。6月上旬(苗期)出現(xiàn)第一個(gè)NR活性高峰，此時(shí)幼苗6片真葉完全展開，之后酶活性下降，7月上旬降至最低，在7月下旬(葉叢形成末期或塊根增長(zhǎng)初期)出現(xiàn)第二個(gè)NR活性高峰，隨后NR活性又下降，在9月中旬(糖分積累期)又出現(xiàn)一個(gè)微弱的高峰。在生育期間出現(xiàn)兩次NR高峰，此結(jié)果與李文華［17］的試驗(yàn)結(jié)果相一致。這兩個(gè)時(shí)期正是氮素的代謝旺盛期，在苗期，根系分化，地上部也在迅速進(jìn)行器官建成，需要較高的NR活性促進(jìn)NO－3吸收和轉(zhuǎn)化，用來(lái)提供較多的氨基酸、蛋白質(zhì)供器官建成;葉叢形成期，甜菜正處于生育盛期，葉叢形成與塊根增長(zhǎng)相重疊，生長(zhǎng)中心開始由葉部轉(zhuǎn)至根部，功能葉片NR活性的適當(dāng)高值并協(xié)同氮代謝的其它酶，既為形成繁茂葉叢，又為塊根增大提供結(jié)構(gòu)蛋白。此后，9月中旬的微弱高峰可能是由于老葉枯死，新葉剛剛長(zhǎng)出的緣故。

內(nèi)源、外源基質(zhì)條件下甜菜葉片NR活性的變化趨勢(shì)基本上一致，在苗期活性最高，葉叢形成末期出現(xiàn)第二個(gè)高峰，峰值遠(yuǎn)小于苗期。各生育時(shí)期，外源基質(zhì)NR(exNR)活性均高于內(nèi)源基質(zhì)NR(enNR)活性，二者的差值在苗期大于甜菜生育后期。在同一取樣時(shí)期，各氮水平間NR活性差異較大，各生育時(shí)期均為高氮處理的酶活性大于低氮處理的酶活性。enNR活性反映的是甜菜營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的生物學(xué)特性，即為甜菜葉片對(duì)氮素的真實(shí)還原速率，而exNR活性反映的是葉片對(duì)NO－3的可利用強(qiáng)度和植株細(xì)胞代謝庫(kù)中NO－3的狀況，即葉片對(duì)氮素的還原潛力，實(shí)際上是間接地反映了甜菜葉片內(nèi)NR酶量的多少。以上結(jié)論可以說(shuō)明，在甜菜生育前期，NR的還原潛力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于生育后期。

圖3 不同氮素水平下內(nèi)源、外源基質(zhì)條件下甜菜葉片NR活性的變化Fig.3 Dynamics of NR(enNR、exNR)activities of sugar beet leaves under different nitrogen levels

2.1.4 甜菜葉片和塊根中NiR活性的動(dòng)態(tài)變化 甜菜葉片中NiR活性在整個(gè)生育期間基本呈“M”型曲線變化(圖4)，幼苗期活性較低，6月22日(苗期)出現(xiàn)第一個(gè)NiR活性高峰，隨后酶活性開始下降，在7月份(葉叢形成期)酶活性持續(xù)最低，在8月7日NiR活性出現(xiàn)第二個(gè)高峰，峰值較第一個(gè)峰值稍有降低，隨后9月上旬(糖分積累期)NiR活性緩慢下降，在9月下旬酶活性又稍有回升，幅度較小。在生育前期地上部生長(zhǎng)較快，氮素代射旺盛，而較多的結(jié)構(gòu)蛋白和酶蛋白完成光合器官的建成，較高的酶活性有利于氮素的吸收和轉(zhuǎn)化，促進(jìn)葉叢生長(zhǎng);生育后期，酶活性顯著減弱，對(duì)氮素吸收減少，氮代謝維持在較低水平，有利于蔗糖的合成和積累。同NR相似，不同氮水平處理的葉片NiR活性具有一致的變化趨勢(shì)。在同一取樣時(shí)期，氮水平之間NiRA差異較大，各生育時(shí)期葉片酶活性均表現(xiàn)為高氮處理大于低氮處理，且無(wú)氮處理的酶活性最低。

圖4 甜菜葉片NiR活性的動(dòng)態(tài)變化Fig.4 Dynamics of NiR activities in sugar beet leaves

苗期塊根中NiR活性最低，幾乎測(cè)不到酶活力，整個(gè)生育期間呈雙峰曲線變化(圖5)。塊根NiR酶活性從苗期開始逐漸升高，至塊根增長(zhǎng)初期(8月7日)出現(xiàn)第一個(gè)高峰，這與葉片中NiR活性變化同步，隨后酶活性下降，直至8月25日最低，在9月中旬有一個(gè)小回升。各生育時(shí)期內(nèi)，塊根NiR活性均低于葉片NiR活性，二者的差值在苗期大于甜菜生育后期。根中兩個(gè)NiR活性高峰皆在生育后期(塊根增長(zhǎng)期和糖分積累期)，這主要是由于生育后期根是甜菜的生長(zhǎng)中心，根中氮代謝旺盛。

圖5 甜菜塊根NiR活性的動(dòng)態(tài)變化Fig.5 Dynamics of NiR activities in sugar beet roots

2.2 氮素水平對(duì)甜菜產(chǎn)量、含糖率及產(chǎn)糖量的影響

由表1知，甜菜產(chǎn)量隨施氮水平的增加而提高，N180水平時(shí)產(chǎn)量最高，達(dá)到63.94 t/hm2;含糖率則正好相反，隨施氮水平的增加而降低，N0處理的含糖率最高，為17.01%;由于產(chǎn)量的極顯著提高伴隨著含糖率的顯著降低，所以N120水平的產(chǎn)糖量最高，為9567.94 kg/hm2。 因此，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，考慮成本以及經(jīng)濟(jì)效益，適宜的施氮量極為重要。產(chǎn)量及產(chǎn)糖量的結(jié)果也符合光合速率的變化規(guī)律(圖1)，高氮水平下的高光合速率為產(chǎn)量的提高提供了條件。本研究中產(chǎn)量、含糖率以及產(chǎn)糖量隨氮水平的變化規(guī)律與馬鳳鳴和高繼國(guó)［18］的研究結(jié)果基本一致。

表1 氮肥對(duì)甜菜產(chǎn)量、含糖率以及產(chǎn)糖量的影響Table 1 Effects of the nitrogen fertilization on yield，sugar content and sugar yield of sugar beet

2.3 氮素與葉綠素含量、NR活性、NiR活性的相關(guān)關(guān)系

相關(guān)性分析結(jié)果(表2)表明，氮素與葉綠素總含量、NR活性、NiR活性皆表現(xiàn)為正相關(guān)關(guān)系，NRA和NiRA在各時(shí)期均表現(xiàn)為顯著正相關(guān)關(guān)系。氮素與葉綠素總含量在生育后期表現(xiàn)為極顯著正相關(guān)，主要是由于生育后期葉片開始走向衰老，葉綠素逐漸降解，而氮素能夠一定程度地延緩功能葉片衰老，減慢葉綠素降解過(guò)程，此結(jié)果與黃兆峰等［19］的研究結(jié)論一致。由于NR、NiR是誘導(dǎo)酶，所以氮素與兩種酶活性在全生育期都表現(xiàn)出顯著正相關(guān)或極顯著正相關(guān)關(guān)系。

2.4 葉綠素含量與酶活性的相關(guān)關(guān)系

相關(guān)性分析結(jié)果(表3)表明，葉綠素總含量與葉片NR、NiR酶活性和塊根NiR酶活性均表現(xiàn)為正相關(guān)關(guān)系，葉叢形成初期相關(guān)極顯著(P＜0.01)，生育后期相關(guān)達(dá)顯著或極顯著水平。葉叢形成末期和塊根形成初期相關(guān)系數(shù)明顯變小。

表2 不同生育時(shí)期施氮量與測(cè)定指標(biāo)的相關(guān)分析Table 2 Correlation analysis between different N levels and the tested indexes at different growth periods

表3 不同生育時(shí)期葉綠素總含量與酶活性的相關(guān)分析Table 3 Correlation analysis between total content of chlorophyll(a+b)and different enzyme activities in sugar beet at different growth periods

3 討論

植物的光合作用受多種因素如土壤水分、光照、溫度、植物本身的生理狀況等綜合因素的影響。本試驗(yàn)是在其他影響基本一致的條件下，研究了氮素水平與葉片光合速率、葉片葉綠素總含量、NRA以及NiRA的關(guān)系。

硝態(tài)氮對(duì)于葉綠素總含量、硝酸還原酶活性(NRA)、亞硝酸還原酶活性(NiRA)皆有促進(jìn)作用。本試驗(yàn)中葉綠素總含量在N0到N120水平內(nèi)，葉綠素總含量隨施氮量的增加而提高，但是N180處理下葉綠素總含量與N120處理時(shí)基本一致，這與曲文章等［20］的研究結(jié)果有一定區(qū)別，可能是由于品種差異，葉綠素總含量在氮素水平120 kg/hm2已經(jīng)達(dá)到單位鮮重的最大量。而兩種酶的活性則是隨著氮水平的增加而升高，表現(xiàn)為 N180＞N120＞N60＞N0。NR活性隨著硝態(tài)氮水平的增加而提高，這與前人在甜菜［6］及小麥［21］中的研究相一致。試驗(yàn)結(jié)果可以看出，葉中NiR活性高峰滯后NR活性一個(gè)時(shí)期，這與氮代謝的過(guò)程一致，首先，硝態(tài)氮被硝酸還原酶還原成亞硝態(tài)氮，然后亞硝態(tài)氮激活亞硝酸還原酶或刺激亞硝酸還原酶表達(dá)，將亞硝態(tài)氮還原成銨。

甜菜光合速率在N120和N180處理下變化較小，此結(jié)果與于海彬［22］的研究一致。可能是甜菜的光合速率主要決定因素在于品種，品種決定了其最大極限，氮素調(diào)控只能使作物盡可能發(fā)揮出潛力;或者是試驗(yàn)過(guò)程中的光強(qiáng)度不足導(dǎo)致光合受限。光合速率變化趨勢(shì)與葉綠素及酶活性的變化趨勢(shì)有差異，可能是植株光合產(chǎn)生的還原力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于單一酶代謝所需，正因此才有富余能量進(jìn)行干物質(zhì)積累，因此光合速率的起伏對(duì)酶活性沒(méi)有明顯影響;也可能是本試驗(yàn)中用光合速率代表光合能力做光合與NR、NiR活性關(guān)系相關(guān)研究不是很適合，試驗(yàn)中所用測(cè)定方法是以單位時(shí)間、單位葉面積CO2的吸收量間接表示光合能力，但是酶活性的主要相關(guān)因素是還原力，光合反應(yīng)中生成的還原力如何分配，有多少提供給NR、NiR進(jìn)行氮代謝并不清楚。因此，可以用葉綠素?zé)晒鉁y(cè)定儀測(cè)定光反應(yīng)階段的光合情況，進(jìn)一步研究光合與NR和NiR的關(guān)系。

將葉綠素總含量的動(dòng)態(tài)規(guī)律與NR活性的動(dòng)態(tài)規(guī)律進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，兩者皆為雙峰曲線，但是葉綠素的含量高峰早于NR活性高峰，可能是因?yàn)镹R需要葉綠素進(jìn)行光合產(chǎn)生還原力，所以葉綠素以及光合系統(tǒng)的建成高峰先于氮素同化的高峰。葉綠素與酶活性的相關(guān)性分析雖然呈現(xiàn)正相關(guān)，但顯著或極顯著時(shí)期較少，可能是由于NR和NiR雖然需要光合提供還原力，但是光合速率的影響因素較多，而且還要考慮呼吸消耗以及其他的能量轉(zhuǎn)化。葉片NiR活性與葉綠素的相關(guān)性較好，可能是由于NiR的還原力是Fd，而Fd直接產(chǎn)生于光反應(yīng)，兩者之間的反應(yīng)過(guò)程直接相連。

4 結(jié)論

光合速率呈單峰曲線變化，NR、NiR活性及葉綠素總含量基本呈雙峰曲線變化。不同施氮量對(duì)甜菜光合速率、葉綠素總含量、硝酸還原酶及亞硝酸還原酶活性的影響不同。氮肥施用量在120 kg/hm2時(shí)顯著提高了甜菜光合速率、葉綠素總含量、NR和NiR活性。與氮肥施用量為120 kg/hm2相比，在180 kg/hm2時(shí)光合速率及葉綠素總含量沒(méi)有明顯變化，NR和NiR活性則有一定的提高。葉綠素總含量與NR和NiR活性在生育中后期表現(xiàn)為顯著或極顯著正相關(guān)關(guān)系。本試驗(yàn)條件下，施氮量為180 kg/hm2時(shí)獲得甜菜產(chǎn)量的最高值63.94 t/hm2，不施氮時(shí)獲得含糖率的最高值17.01%，施氮量120 kg/hm2時(shí)獲得產(chǎn)糖量的最高值9567.94 kg/hm2。

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