王頌佩，李曉敏，劉春儀，欽曉峰，陳正平（江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所/衛(wèi)生部核醫(yī)學(xué)重點實驗室/江蘇省分子核醫(yī)學(xué)重點實驗室，江蘇無錫 214063）

HPLC法測定丁苯那嗪原料藥含量Δ

王頌佩＊，李曉敏，劉春儀，欽曉峰，陳正平#（江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所/衛(wèi)生部核醫(yī)學(xué)重點實驗室/江蘇省分子核醫(yī)學(xué)重點實驗室，江蘇無錫 214063）

目的：建立測定丁苯那嗪原料藥含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Lichrospher C18，流動相為乙腈-50mmol·L－1醋酸銨緩沖液（pH 4.50）＝80∶20，流速為0.8mL·min－1，檢測波長為280nm。結(jié)果：丁苯那嗪檢測濃度線性范圍為0.1～5.0mg·mL－1（r＝0.9991），平均回收率為99.93%，RSD為0.78%。結(jié)論：該方法簡便可靠，可用于丁苯那嗪原料藥的含量測定。

丁苯那嗪；高效液相色譜法；含量測定

丁苯那嗪（Tetrabenazine，TBZ）通過選擇性阻斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的囊泡單胺轉(zhuǎn)運體（VMAT2）來發(fā)揮作用，用于控制運動功能障礙。2008年8月經(jīng)美國FDA以快速審批資格批準(zhǔn)上市，成為首個且唯一在美國獲準(zhǔn)用于治療亨廷頓舞蹈?。℉untington’s disease，HD）的藥物[1，2]。目前，該藥已在其他14個國家通過批準(zhǔn)，有望不久的將來在中國上市。筆者合成了TBZ原料藥[3]，在本文中介紹了采用高效液相色譜（HPLC）法測定TBZ含量的方法。

TBZ化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 TBZ的化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig 1 The chemical structure of tetrabenazine

1 儀器與試藥

HPLC儀，包括1525泵、2487紫外檢測器（美國Waters公司）。

TBZ 原料藥（批號：20100801、20101028、20110309，純度：＞97.0%）及TBZ對照品（由原料藥精制而成，純度：99.9%）均由衛(wèi)生部核醫(yī)學(xué)重點實驗室提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Lichrospher C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈-50mmol·L－1醋酸銨緩沖液（pH 4.50）＝80∶20，流速：0.8mL·min－1；檢測波長：280nm；進(jìn)樣量：10μL。

取“2.2”項下對照品和供試品溶液，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，結(jié)果主峰與雜質(zhì)峰分離良好，理論板數(shù)以TBZ計＞4200，且主峰的保留時間比較合適，色譜見圖2。

圖2 高效液相色譜圖A.對照品；B.供試品；1.TBZFig 2HPLC chromatogramsA.substance control；B.test sample；1.TBZ

2.2 溶液制備

對照品溶液：精密稱取干燥至恒重的TBZ對照品50.0mg，置于10mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻，即得5.0mg·mL－1的貯備液，再稀釋為1.0mg·mL－1的對照品溶液。

供試品溶液：稱取干燥至恒重的TBZ原料藥10.0mg，置于10mL量瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻，即得1.0mg·mL－1的供試品溶液。

2.3 破壞性試驗

精密稱取3份TBZ對照品5.0mg，置于5mL量瓶中，分別加入3種溶液：（1）0.05mol·L－1的鹽酸溶液2.0mL；（2）含0.1mol·L－1氫氧化鈉的甲醇溶液2.0mL；（3）30%的雙氧水0.2mL。室溫放置1h，加流動相至刻度，搖勻，分別作為酸破壞溶液、堿破壞溶液及氧化破壞溶液，進(jìn)樣分析，色譜圖見圖3A、B、C。

圖3 破壞性試驗高效液相色譜圖A.酸破壞溶液；B.堿破壞溶液；C.氧化破壞溶液；D.高溫破壞溶液；1.TBZ；2～5.降解產(chǎn)物Fig 3 HPLC chromatograms of destructive testsA.acid destructive solution；B.base destructive solution；C.oxidative destructive solution；D.thermal destructive solution；1.tetrabenazine；2～5.degraded products

精密稱取TBZ對照品5.0mg，置于5mL量瓶中，加入流動相2.0mL，80℃加熱2h，放置冷卻，加流動相至刻度，搖勻，作為高溫破壞溶液，進(jìn)樣分析，色譜圖見圖3D。

試驗結(jié)果表明，酸、堿、氧化破壞后的降解產(chǎn)物與主成分峰分離良好；而高溫（80℃）破壞后，未見有明顯雜質(zhì)。

由于本品較穩(wěn)定，故未進(jìn)行光照破壞試驗。

2.4 最低檢測限的測定

取對照品溶液定量稀釋，進(jìn)樣分析。結(jié)果，本品的最低檢測濃度為0.32μg·mL－1，最低檢測限為3.2ng（S/N＝3）。

2.5 線性關(guān)系試驗

精確量取一定量的TBZ對照品溶液1.0、2.0、5.0mL及貯備液2.0、4.0mL，用甲醇稀釋制成濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0mg·mL－1的溶液，進(jìn)樣分析上述溶液及對照品溶液，記錄色譜圖，每個濃度測定2次，取峰面積的平均值。以峰面積（A）對濃度（c）作圖進(jìn)行線性回歸，得方程為A＝7×106c+2.3792×105（r＝0.9991）。結(jié)果表明，TBZ檢測濃度線性范圍為0.1～5.0mg·mL－1。

2.6 精密度試驗

取同一對照品溶液在同日內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次測定，根據(jù)峰面積計算RSD＝1.04%。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液分別于室溫放置1、3、5d后進(jìn)樣測定，根據(jù)峰面積計算RSD＝1.20%，表明溶液在室溫下5d內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗

取同一批號原料藥，共6份，分別制成供試品溶液后進(jìn)樣測定，計算得含量RSD＝1.05%，表明本方法重復(fù)性較好。

2.9 回收率試驗

精密稱取TBZ原料藥適量，制備成含TBZ分別為0.8、1.0、1.2mg·mL－1的溶液各3份，分別進(jìn)樣測定。計算得平均回收率為99.93%，RSD＝0.78%（n＝9），結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗結(jié)果（n＝9）Tab 1Results of recovery test（n＝9）

2.10 樣品含量測定

取對照品溶液和供試品溶液分別進(jìn)樣測定，根據(jù)峰面積計算3批原料藥中TBZ的含量分別為97.07%、97.21%和98.07%，RSD分別為1.38%、1.47%和1.39%（n＝3）。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

取TBZ的甲醇溶液在200～600nm波長進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果顯示，在280nm波長附近處有最大吸收峰，因此，檢測波長確定為280nm。

3.2 流動相的選擇

TBZ為酮類化合物，筆者曾選擇乙腈-50mmol·L－1醋酸銨緩沖液（pH 4.50）體積比分別為a（30∶70）、b（50∶50）、c（70∶30）、d（80∶20）4種流動相，進(jìn)樣記錄色譜圖。結(jié)果顯示以a、b為流動相時，色譜峰吸收很低；以c為流動相時，分離良好而保留時間偏長；而以d為流動相，分離效果優(yōu)于c，以此確定為本試驗所用流動相。

綜上所述，該方法簡便可靠，可用于TBZ原料藥的含量測定。

[1] 楊久匣，張玉萍，張紅苗，等.治療舞蹈病藥物——丁苯那嗪[J].中國藥學(xué)雜志，2009，44（12）：959.

[2] Hayden MR，Leavitt BR，Yasothan U，et al.Tetrabenazine[J].Nat Rev Drug Discov，2009，8（1）：17.

[3] Liu CY，Chen ZP，Li XM，et al.A concise synthesis of tetrabenazine and its crystal structure[J].Mol Cryst&Liq Cryst，2012，557（1）：39.

Content Determination of Tetrabenazine Raw Material by HPLC

WANG Song-pei，LI Xiao-min，LIU Chun-yi，QIN Xiao-feng，CHEN Zheng-ping（Jiangsu Institute of Nuclear Medicine/Key Laboratory of Nuclear Medicine of Ministry of Health/Jiangsu Key Laboratory of Molecular Nuclear Medicine，Jiangsu Wuxi 214063，China）

OBJECTIVE：To determine the content of tetrabenazine raw material.METHODS：HPLC method was adopted.Lichrospher C18column was used with the mobile phase of acetonitrile-50mmol·L－1ammonium acetate buffer（pH＝4.50）（80∶20）at the flow rate of 0.8mL·min－1.The detection wavelength was set at 280nm.RESULTS：The linear range of tetrabenazine was 0.1～5.0mg·mL－1（r＝0.9991）with an average recovery of 99.93%（RSD＝0.78%）.CONCLUSIONS：The method is simple and reliable.It can be used for the content determination of tetrabenazine raw material.

Tetrabenazine；HPLC；Content determination

R927.2

A

1001-0408（2012）33-3125-02

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2012.33.20

Δ國家自然科學(xué)基金資助項目（30970844）；江蘇省科技項目（BK2010155）

＊助理研究員。研究方向：放射性藥物。電話：0510-85508782。E-mail：wangsongpei@jsinm.org

#通訊作者：副研究員，博士。研究方向：放射性藥物。電話：0510-85514482。E-mail：chenzhengping@jsinm.org

2011-09-15

2012-03-16）