杜汴興，于喜樂

(1．中國平煤神馬醫(yī)療集團總醫(yī)院，河南 平頂山467000;2．河南中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州450000)

不孕不育的治療是維持生殖健康的一個重要方面。排卵障礙性不孕的比例約占不孕癥的20%～25%。引起排卵障礙性不孕的原因主要有中樞神經性無排卵、下丘腦性無排卵、垂體性無排卵、卵巢性無排卵、多囊卵巢綜合征和卵巢黃素化不破裂綜合征等。對于本病的研究，無論是中醫(yī)學還是現(xiàn)代醫(yī)學，均取得了一定的進展。目前現(xiàn)代醫(yī)學治療排卵障礙性不孕的方法主要是服用促排卵藥物，但其產生的副作用越來越受到人們的關注。中醫(yī)藥的治療具有廉、便、效、驗的特點，且有較少毒副作用。本課題是以筆者多年臨床經驗總結而出的腎—子宮生理生殖軸理論為指導，通過觀察補腎促排卵顆粒劑對高雄激素所致的抑孕小鼠促排卵的影響，探討其作用機制，從而為臨床運用提供理論依據。

1 材料與方法

1．1 動 物

昆明種雌性小鼠，20 日齡，體質量18～22 g，由鄭州大學動物實驗中心提供，合格證號:SCKX(豫)2005－0001。

1．2 藥品、試劑與儀器

補腎促排卵顆粒劑由丹參、合歡皮、熟地黃、茺蔚子、川牛膝、川續(xù)斷、五靈脂、紅花等藥物組成，由河南中醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院顆粒劑藥房提供，為廣東一方制藥有限公司產品。將顆粒劑用蒸餾水溶解，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。枸椽酸氯米芬膠囊，上海衡山藥業(yè)有限公司產品，批號H31021107，用時將膠囊內容物制成混懸液;丙酸睪丸酮注射液，上海通用藥業(yè)股份有限公司產品，批號090302。SP9003 免疫組化試劑盒，由北京中杉金橋生物技術有限公司提供，批號40480459。婦科內分泌酶聯(lián)免疫測定藥盒(批號31180013)及儀器(Access 型號)，由美國Beekman－coulter 公司提供。DF110 型電子分析天平，北京賽多利斯天平有限公司產品;LDZ－52 型低速自動平衡離心機，北京醫(yī)用離心機廠產品;BX60 型Olypus 顯微攝影系統(tǒng)，產地日本。

1．3 動物分組與模型的建立

將小鼠按體質量隨機分層分為6 組，每組16 只。正常對照組16 只，頸背皮下注射生理鹽水;余下80 只造模，參照俞瑾［1］的頸背皮下注射丙酸睪丸酮的方法:將80 只小鼠頸背皮下注射0．06 mL 丙酸睪丸酮，每4 d 1 次，連續(xù)注射2 周，停藥1 周。將造模后的小鼠隨機分為模型對照組、枸椽酸氯米芬膠囊組和補腎促排卵顆粒劑大、中、小劑量組。均分籠喂養(yǎng)，每組2 籠，自然光照，室溫17～20 ℃，濕度50%～70%，喂以顆粒飼料，自由飲水。

1．4 給藥方法

補腎促排卵顆粒劑大、中、小劑量組依次給以8．33，4．11，2．08 g/kg 補腎促排卵顆粒劑顆?；鞈乙?，枸椽酸氯米芬膠囊組給以16．67 μg/g 枸椽酸氯米芬膠囊混懸液，分別按小鼠體質量(0．02 mL/g)、組別灌胃給藥，每日1 次。正常對照組、模型對照組按體質量給以等容積生理鹽水。連用4 周后，停藥48 h，每組處死8 只，另余8 只做受孕率實驗。因部分標本組織處理不當，故各組測試樣品數(shù)量不同。

1．5 檢測指標

1．5．1 血清雌二醇(E2)

停止灌胃48 h，小鼠眼眶取血，分離血清，酶聯(lián)免疫法檢測E2(送檢)。

1．5．2 卵巢、子宮臟器指數(shù)

處死小鼠，剖開腹腔，切取子宮和卵巢，剝離周圍脂肪組織，迅速以扭力天平稱濕質量，并按公式計算臟器系數(shù)。臟器系數(shù)=臟器質量/體質量×100。1．5．3 卵巢組織形態(tài)學

卵巢取出后，經100 g 甲醛固定，組織切片經HE 染色及油紅O 染色處理后，在普通光學顯微鏡下觀察。

1．5．4 雌激素受體(ER)

采用免疫組化法檢測。子宮取出后，經100 g/L甲醛固定，組織切片石蠟包埋，4 μm 切片，雌激素受體標記，蘇木素復染后光鏡觀察。

1．5．5 各組小鼠用藥后雌雄合籠受孕情況

將每籠8 只小鼠內放入2 只正常成熟雄性小鼠，合籠10 d 后，解剖子宮，觀察其受孕情況。

1．6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13．0 統(tǒng)計分析軟件處理。計量資料數(shù)據以均數(shù)()± 標準差(s)表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0．05 為差別有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2．1 各組小鼠卵巢指數(shù)、子宮指數(shù)對比

與模型對照組對比，補腎促排卵顆粒劑大、中劑量組的卵巢指數(shù)和大、中劑量組的子宮指數(shù)增加，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0．05 或P＜0．01);而補腎促排卵顆粒劑小劑量組、枸椽酸氯米芬膠囊組與模型對照組比較，子宮指數(shù)差別無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)。見表1。

表1 各組小鼠卵巢指數(shù)、子宮指數(shù)對比 x－ ±s

2．2 各組小鼠血清中E2 含量對比

模型對照組E2含量與正常對照組對比，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)。用藥后枸椽酸氯米芬膠囊組與模型對照組對比，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0．05);補腎促排卵顆粒劑大、中劑量與模型對照組對比，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0．01);但補腎促排卵顆粒劑小劑量組，差別無統(tǒng)計學意義(P＞0．05)。說明補腎促排卵顆粒劑大、中劑量對造模小鼠的雌激素水平有使其恢復正常的作用，且程度接近枸椽酸氯米芬膠囊組。見表2。

表2 各組小鼠血清中E2 含量對比 ±s

表2 各組小鼠血清中E2 含量對比 ±s

注:與正常對照組對比，* P ＜0．05;與模型對照組對比，# P ＜0．05，## P ＜0．01。

組 別 動物數(shù) E2/(μg·L －1)9．83 ±2．86模型對照組 7 6．29 ±1．80*枸椽酸氯米芬膠囊組 6 13．50 ±5．08#補腎促排卵顆粒劑大劑量組 7 15．75 ±2．94##補腎促排卵顆粒劑中劑量組 6 17．50 ±4．02#補腎促排卵顆粒劑小劑量組正常對照組6 8．83 ±2．86 6

2．3 各組小鼠卵泡數(shù)量、卵細胞數(shù)量、間質腺成分及ER 表達率對比

鏡下觀察結果顯示:模型對照組可見大量原始竇狀卵泡，卵細胞結構不清，卵泡直徑小，內含大量漿液性物質，生長卵泡數(shù)目較少，黃體數(shù)量少。正常對照組可見各期卵泡及黃體組織。補腎促排卵顆粒劑大、中、小劑量組均可使卵巢的黃體數(shù)量增加，間質腺發(fā)達，促進卵泡的發(fā)育、排卵及黃體生成。其中補腎促排卵顆粒劑大、中、小劑量組接近于正常組，而枸椽酸氯米芬膠囊組沒有發(fā)現(xiàn)黃體，間質腺成分比例明顯低于補腎促排卵顆粒各組。

補腎促排卵顆粒劑大、中、小劑量組卵細胞數(shù)、卵泡數(shù)量與模型對照組對比，差別均有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)，與正常對照組接近。而ER 表達率補腎促排卵顆粒劑大、中、小劑量組、枸椽酸氯米芬膠囊組與模型對照組比較，差別均有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)。見表3。

從本實驗可以看出:造模對間質的影響不明顯，枸椽酸氯米芬膠囊組用藥后對間質腺體的影響不大，而補腎促排卵顆粒劑大、中、小劑量組的實驗動物用藥后間質腺體的水平高于正常對照組。這也從一個側面說明:補腎促排卵顆粒劑是通過整體調節(jié)生殖器官的功能發(fā)揮作用，而不是單一對卵泡的刺激。

表3 各組小鼠卵泡數(shù)量、卵細胞數(shù)量、間質腺成分及ER 表達率對比 ±s

表3 各組小鼠卵泡數(shù)量、卵細胞數(shù)量、間質腺成分及ER 表達率對比 ±s

注:與正常對照組對比，* P ＜0．05，＊＊ P ＜0．01;與模型對照組對比，# P ＜0．01。

組 別 動物數(shù) 卵泡數(shù)量/個 卵細胞數(shù)量/個 間質腺成分 ER 表達率/%正常對照組12．5 ±2．0 12．5 ±2．0 25．00 ±7．01 34．17 ±5．34模型對照組 6 9．2 ±2．1 2．4 ±0．7 45．00 ±9．88 60．00 ±9．13＊＊枸椽酸氯米芬膠囊組 6 34．3 ±5．9## 6．2 ±1．6# 21．67 ±4．80 11．17 ±3．44##補腎促排卵顆粒劑大劑量組 6 28．4 ±3．6## 5．4 ±1．4## 31．67 ±1．00* 33．30 ±5．04##補腎促排卵顆粒劑中劑量組 6 21．7 ±3．8## 5．1 ±1．1## 45．83 ±6．52* 16．00 ±6．06#補腎促排卵顆粒劑小劑量組 6 23．2 ±2．6## 5．4 ±1．3## 36．76 ±5．53* 29．60 ±3．77 6#

2．4 各組小鼠受孕情況對比

補腎促排卵顆粒劑大劑量組的妊娠率與枸椽酸氯米芬膠囊組、正常對照組相當，說明補腎促排卵顆粒劑大劑量組與枸椽酸氯米芬膠囊組一樣可以恢復造模實驗動物的生理功能。見表4。

表4 各組小鼠受孕情況對比

3 討 論

中醫(yī)學認為:腎藏精，為天癸之源，司生殖，精卵藏之于腎，所以腎為生殖之本?，F(xiàn)代醫(yī)學認為:卵子生成于卵巢，卵泡卵子是卵巢的主要組成部分，卵泡的發(fā)育、卵子的成熟、排卵的順利，均有賴于雌激素水平不斷提高［2］。因此，雌激素與卵泡、卵子的關系類乎于腎陰、癸水、與精的密切關系，即中醫(yī)學的腎－天癸－沖任－胞宮與下丘腦－垂體－卵巢環(huán)路相應。故本實驗用以補腎活血通絡為原則組方的促排卵顆粒劑調節(jié)卵巢功能，促發(fā)排卵實驗，從而為中醫(yī)藥治療排卵功能障礙性不孕癥提供新思路。

3．1 補腎促排卵顆粒對子宮、卵巢的影響

本研究顯示:補腎促排卵顆粒劑使實驗動物卵巢、子宮質量增加，并增加卵丘及卵泡、黃體的數(shù)量，使間質腺發(fā)達，促進卵泡的發(fā)育，且大劑量組和中劑量組作用明顯。補腎促排卵顆粒劑大、中、小劑量組卵細胞數(shù)、卵泡數(shù)與模型對照組對比，差別有統(tǒng)計學意義，與正常對照組接近。對E2的影響:補腎促排卵顆粒劑可以提高模型對照組小鼠血中的E2水平，其作用機制可能是通過調整性腺軸的功能，從而促使造模動物恢復排卵功能。從此實驗看，補腎促排卵顆粒劑大劑量組的效果要優(yōu)于小劑量組。

3．2 補腎促排卵顆粒對實驗動物子宮內膜ER 的影響

補腎促排卵顆粒劑大、中、小劑量組、枸椽酸氯米芬膠囊組的ER 表達率與模型對照組對比，差別有統(tǒng)計學意義，且中藥組均優(yōu)于枸椽酸氯米芬膠囊組。雌激素受體是雌激素發(fā)揮作用的橋梁。如果E2水平低，會導致ER 合成障礙。子宮內膜的功能也可以反映受精卵著床的情況，排卵前雌激素水平作為孕激素參與胚泡著床是不可少的。只有腺上皮ER 在圍著床期下降、滋養(yǎng)細胞侵入子宮內膜才能使孕激素支持著床，也只有當腺上皮ER、PR 表達量明顯降低，內膜處于可容受狀態(tài)，才是胚胎著床的最佳時機。由于子宮內膜的功能也可以反映受精卵著床的情況，其中生殖器官的發(fā)育依賴于激素的作用，子宮是雌激素的靶器官，雌激素能增進子宮血液的運行，促進其平滑肌細胞增生、肥大。雌激素的生理作用是由雌激素受體介導的拼體激素對子宮靶器官的效應。雌激素的生物學效應應取決于雌激素水平ER 的含量，以ER 數(shù)為指標可以判定藥物的激素活性。

3．3 展 望

人工輔助生殖技術的發(fā)展對促排卵治療提出了更高的要求。隨著對排卵機制和卵巢周期調節(jié)機制的深入了解，促排卵方法在不斷地改進，可仍有許多不盡人意之處，如可出現(xiàn)卵巢過度刺激癥候群、卵巢反應不良、多胎妊娠、自然流產、乳腺癌、子宮內膜癌等［3－6］。傳統(tǒng)的中醫(yī)藥的安全性與有效性，在治療排卵障礙性不孕癥得到了醫(yī)者的重視，同時在輔助生殖技術的前后使用中醫(yī)藥進行調理，也使其成功率得到提高。在治療方面，眾多有關補腎藥的研究表明:補腎中藥具有明顯的調經和促排卵作用，其強度可增加50%～100%，可提高排卵細胞質量和卵裂能力，且是以增加正常卵細胞和卵裂細胞為主，對卵細胞質量和卵裂過程不產生異常影響［7］。本研究從雌激素水平、雌激素受體、卵巢組織形態(tài)學角度，證明了補腎促排卵顆粒劑對下丘腦－垂體－卵巢軸的功能的影響，對臨床上運用該方治療排卵障礙性不孕提供了實驗依據，作出了有意義的探索。在今后的工作與研究中可從分子生物學、藥物指紋學等多學科探討中醫(yī)藥治療排卵障礙性不孕癥的機制，更好地發(fā)揮中醫(yī)藥在治療該病中的優(yōu)勢。

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