謝晶華 解智慧 史祖宣 樊青霞 (鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科一病區(qū)，河南 鄭州 450052)

孕烷X受體抗食管癌EC9706細胞凋亡的作用機制

謝晶華 解智慧 史祖宣 樊青霞 (鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科一病區(qū)，河南 鄭州 450052)

目的 研究孕烷X受體(PXR)抗食管癌EC9706細胞凋亡的作用機制。方法 使用利福平活化食管鱗癌 EC9706細胞中的PXR，阿霉素(ADM)誘導(dǎo)高表達PXR的EC9706細胞凋亡，采用流式細胞儀觀察細胞的增殖周期，MTT法觀察細胞凋亡率，Western印跡和免疫組化法檢測Caspase-3，Bcl-2，Bax蛋白表達情況。結(jié)果 ADM處理可以明顯抑制細胞生長;使細胞呈明顯凋亡改變;利福平誘導(dǎo)PXR高表達的EC9706細胞凋亡減少，抑制Caspase-3的蛋白水平，上調(diào)蛋白Bcl-2的表達，表明PXR在抗食管鱗癌細胞凋亡中發(fā)揮重要的作用。結(jié)論 PXR可能是通過降低Caspase-3和升高Bcl-2蛋白的表達抑制食管癌細胞EC9706的凋亡。

食管癌;細胞凋亡;孕烷X受體;Caspase-3;Bcl-2

孕烷X受體(PXR)，亦稱為類固醇X受體，其主要生物學(xué)功能是參與機體對內(nèi)源及外源化合物的代謝及排泄過程，是核受體家族重要成員之一。核受體在藥物代謝轉(zhuǎn)運和藥物之間相互作用中扮演重要角色，尤其是PXR，其配體具有泛宿主性，很多藥物包括抗癌藥物都是其配體。近幾年對PXR的基因定位、基因結(jié)構(gòu)特點、組織分布、作用機制及其與多種腫瘤的關(guān)系等研究取得一定進展。本文擬研究PXR在抗食管癌 EC9706細胞凋亡的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人食管癌細胞株EC9706購自中國科學(xué)院上海細胞生物學(xué)研究所;RPMI1640培養(yǎng)基購自英國DIOMED;胎牛血清(FBS)購自O(shè)dyssey公司;胰蛋白酶購自Gibco公司;MTT試劑盒購自美國Sigma公司;羊抗鼠熒光二抗700購自LI-COR Biosciences基因公司;羊抗兔熒光二抗800購自LI-COR Biosciences基因公司;總RNA抽提試劑盒和RT-PCR反應(yīng)試劑盒購自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;HRP標記的羊抗鼠的二抗購自Rockland公司;β-actin鼠抗人的單抗購自 Sigma公司;BCA標準蛋白檢測系統(tǒng)購自Pierce公司;蛋白預(yù)染Marker購自Fermentas公司。

1.2 MTT法檢測細胞活力

將EC9706細胞分為兩組，一組加0.1%二甲基亞砜(DMSO)作為處理對照組，另一組加10 μmol/L利福平作為處理組。預(yù)處理24 h后，接種于96孔板，每孔約1×103個細胞，設(shè)定3個復(fù)孔，兩組均設(shè)調(diào)零空白對照組(不加細胞，只加相應(yīng)培養(yǎng)基)，連續(xù)培養(yǎng)，繼續(xù)分別加入0.1%DMSO、10 μmol/L 利福平進行處理。將 1 μg/ml ADM 分別加入處于對數(shù)生長期的細胞培養(yǎng)瓶中，在第1、3、5、7天時，每孔加入 MTT溶液(5 mg/ml)20 μl，37℃孵育4 h后，小心吸去培養(yǎng)液，加入150 μl DMSO，溶解紫色結(jié)晶物，在微孔板振蕩器上震蕩10 min。用Model 550型酶標儀在波長490 nm測吸光度(OD值)，以空白對照組調(diào)零。試驗重復(fù)3次，取均值。

通過下列公式計算細胞生長抑制率：生長抑制率(%)=(實驗組 OA490值-對照組 OA490值)/對照組OA490值×100%。

1.3 流式細胞儀檢測細胞周期

將對數(shù)生長期的EC9706細胞用不含血清的新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)8 h，使細胞停止生長，處于同一細胞周期，然后將細胞制成懸液，調(diào)整細胞數(shù)為4×104個/ml，各取5 ml細胞懸液培養(yǎng)于75 ml細胞培養(yǎng)瓶，常規(guī)培養(yǎng)、消化、離心、收集各用藥組(一組加0.1%DMSO作為處理對照組，另一組加10 μmol/L利福平作為處理組)和陰性對照組培養(yǎng)48 h的EC9706細胞，將1 μg/ml ADM分別加入處于對數(shù)生長期的細胞培養(yǎng)瓶中，用冷PBS液洗滌細胞兩次，加入預(yù)冷70%的乙醇并均勻吹打，盡量制備成單細胞懸液，4℃冰箱固定24 h，隨后再用冷PBS液洗滌細胞兩次去除固定液，加1 ml碘 化 丙 錠 染 液(含 碘 化 丙 錠 100 μg/ml，RNA 酶100 μg/ml)，混勻，置4℃避光染色30 min，上流式細胞儀，用氬離子激發(fā)碘化丙錠產(chǎn)生紅色熒光，記錄激發(fā)波長488 nm處紅色熒光，檢測細胞DNA含量。用計算機自帶Multicycle(Phoenix Flow System，San Diego，CA，USA)軟件分析，計算凋亡細胞百分數(shù)及細胞周期百分數(shù)。

1.4 Western印跡檢測高表達PXR蛋白的EC9706細胞以及野生型 EC9706細胞中 Bcl-2、Caspase-3、B

(1)將EC9706細胞分為兩組：一組加0.1%DMSO作為處理對照組，另一組加10 μmol/L利福平作為處理組。將1 μg/ml ADM分別加入處于對數(shù)生長期的細胞培養(yǎng)瓶中，作用48 h后，提取細胞核蛋白。約6×106個細胞，加預(yù)冷PBS漂洗2次，用細胞刮子快速將細胞刮下，500 r/min×3 min，棄上清，盡可能干燥沉淀，加200 μl細胞質(zhì)蛋白和細胞核蛋白抽提試劑(CERI)，劇烈漩渦振蕩15 s，充分重懸，冰上10 min。

(2)從不同蛋白樣品中取出等量蛋白(50 μg)與1×SDS凝膠上樣緩沖液混合，加入4%體積的 β-巰基乙醇，煮沸10 min。然后在4℃下，15 000 r/min離心5 min。蛋白上樣，經(jīng)由10%SDS-PAGE分離膠分離，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。將此膜取下，剪角后在5%脫脂奶粉封閉液中緩慢搖動2～4 h。然后。將特異性一抗按1∶1 000～1∶2 000稀釋。與膜一起孵育過夜。1×PBST洗滌3次，每次10 min。隨后將此膜與相應(yīng)的二抗(1∶3 000～1∶4 000)一起孵育4 h。在1×PBST洗滌3次后，利用增強性化學(xué)發(fā)光試劑盒(ECL)檢測特異性蛋白條帶。由兩位資深科研中心教授獨立觀察每張切片后一起做出判斷。每例切片隨機選擇10個高倍視野(×400)，每個視野計數(shù)100個細胞。

參照吳嬋妮等〔2〕的方法如下計算結(jié)果：陽性率=(陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù))×100%。

1.5 免疫組化法檢測EC9706細胞中的Capase-3、Bcl-2和Bax蛋白表達

載玻片經(jīng)泡酸、清洗、高溫滅菌后置于6孔培養(yǎng)板中，取對數(shù)生長期細胞胰酶消化成單細胞懸液后，將EC9706細胞分為兩組：一組加0.1%DMSO作為處理對照組，另一組加10 μmol/L利福平作為處理組。將1 μg/ml ADM分別加入處于對數(shù)生長期的細胞培養(yǎng)瓶中，作用48 h后，以每毫升2×105個細胞濃度接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔2.5 ml，培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，丙酮固定10 min。室溫下0.5%H2O2-甲醇作用30 min，山羊血清封閉1 h，PBS洗滌后滴加一抗，4℃過夜，PBS洗滌后滴加生物素標記的兔抗鼠二抗工作液，室溫作用30 min，PBS洗滌后滴加辣根酶標記鏈酶卵白素工作液作用1 h，PBS洗滌后DAB顯色5 min，蘇木素復(fù)染，中性樹脂封片，倒置顯微鏡下觀察。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 EC9706細胞生長曲線和倍增時間

在液體懸浮培養(yǎng)條件下，EC9706細胞呈單個散在貼壁生長。細胞種植密度為5×104/ml，此濃度細胞從換液后的第24～96小時呈指數(shù)增殖，實驗測得EC9706細胞倍增時間為20～24 h(見圖1)。

圖1 食管癌EC9706細胞生長曲線

2.2 利福平活化核受體PXR對食管癌EC9706細胞增殖和化療敏感性的影響

2.2.1 利福平對食管癌EC9706細胞核受體PXR表達的影響

根據(jù)以上結(jié)果，選擇EC9706細胞作為研究PXR基因功能的對象。EC9706細胞經(jīng)10 μmol/L利福平處理 48 h后，提取EC9706細胞核蛋白，采用Western印跡方法進一步檢測PXR核蛋白表達水平變化。分子量50 kD位置，與0.1%DMSO處理對照組相比，利福平處理組核蛋白條帶明顯增粗，顯色較深。這表明利福平刺激后可增強PXR蛋白在EC9706細胞核內(nèi)表達(圖2)。以上結(jié)果表明，利福平預(yù)處理后，可活化PXR，增強其核蛋白表達水平。

2.2.2 利福平活化PXR對食管癌細胞增殖的影響 在10 μmol/L利福平作用下，EC9706細胞增殖明顯加快，第3、5、7天的490 nm波長處吸光度值(OD)分別為：0.682±0.048、1.183±0.156、1.817±0.095;而0.1%DMSO處理對照組相應(yīng)的OD值分別為：0.528±0.035、0.920±0.036、1.402±0.092。相應(yīng)時間內(nèi)，利福平組OD值均明顯高于DMSO組(P＜0.05)。而第1天，利福平組和DMSO組OD值〔(0.155±0.006)vs(0.163±0.004)〕之間沒有顯著差異(P＞0.05)。結(jié)果表明利福平活化PXR后，可促進EC9706細胞增殖。見圖3。

圖2 利福平處理EC9706細胞后PXR表達變化

圖3 利福平對EC9706細胞增殖的影響

2.3 PXR在抗ADM誘導(dǎo)EC9706細胞凋亡中的作用

2.3.1 流式細胞儀觀察到的ADM處理空白組和PXR+利福平組EC9706細胞的增殖周期 在1 μg/ml阿霉素作用下，DMSO組EC9706細胞增殖明顯加快，相應(yīng)時間內(nèi)，利福平組OD值均明顯低于DMSO組(P＜0.05)。結(jié)果表明利福平活化PXR后，可抑制EC9706細胞增殖。見圖4。

2.3.2 MTT觀察ADM處理空白組和PXR+RIF組EC9706細胞的凋亡率 在1 μg/ml ADM作用下，ADM處理的DMSO組EC9706細胞凋亡明顯增多(P＜0.01);ADM處理的RIF組EC9706細胞凋亡明顯增多(P＜0.01)。結(jié)果表明利福平活化PXR后，再用利福平處理后可降低EC9706細胞的凋亡率。見圖5。

2.3.3 Western印跡檢測ADM對利福平與DMSO組EC9706細胞中Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表達的影響 ADM處理EC9706細胞后Caspase-3、Bcl-2和Bax的蛋白表達，以光密度指數(shù)(OD)表示三種蛋白表達的相對含量。所有樣品檢測均以DMSO處理組細胞為空白對照，用ipp7c軟件計算出Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白的OD值。ADM處理的PXR+利福平組的Caspase-3蛋白的FI值均低于對照組;Bcl-2蛋白的OD值均高于對照組(P＜0.05或P＜0.01)。但Bax蛋白的OD值與對照組相比，則無明顯差異(P＞0.05)(圖6)。

圖4ADM處理DMSO組和RIF組對EC9706細胞增殖的影響

圖5ADM處理DMSO組和RIF組EC9706細胞凋亡率的影響

圖6 Western印跡檢測ADM處理DMSO組和利福平組EC9706細胞Caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表達的影響

2.3.4 免疫組化法觀察到ADM處理的DMSO組和RIF+PXR組的Caspase-3，Bcl-2，Bax的表達情況 Caspase-3主要定位于細胞質(zhì)，也可見于細胞核。Bcl-2和Bax定位于細胞質(zhì)，亦可見于胞膜和核膜。著色明顯高于背景，在相應(yīng)部位出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性細胞，不著色或顯色強度與背景無差別者為陰性細胞。見圖7。

圖7 免疫組化法觀察到ADM處理的兩組Caspase-3、Bcl-2和Bax的表達情況(×400)

3 討論

PXR可通過上調(diào)多重抗凋亡基因包括 BAG3、BIRC、2MCL-1，下調(diào)凋亡基因如 BAKl、TP53/P53，Bcl-xL而起到對抗細胞凋亡的功能，從而對抗 DCA/LCA誘導(dǎo)的結(jié)腸癌變〔3〕。Daisuke等〔4〕報道PXR在食管鱗癌中是高表達的，而且是判斷ESCC患者的一種潛在的預(yù)后因子。

ADM是一種常見的抗腫瘤藥物，其抗瘤譜較廣，對乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、肝癌等多種癌癥都有一定療效，而且是治療食管癌效果最好的化療藥物之一。ADM屬細胞周期非特異性藥物，對各種生長周期的腫瘤細胞都有殺滅作用。已有文獻報道，ADM誘導(dǎo)細胞凋亡的分子機制，可能是由于其部分分子結(jié)構(gòu)可嵌入到DNA雙鏈中形成穩(wěn)定的復(fù)合物，影響DNA的結(jié)構(gòu)和功能，阻止DNA復(fù)制和RNA的合成，還能抑制拓撲異構(gòu)酶Ⅱ的功能，從而抑制腫瘤細胞的分裂和增殖〔1〕。有研究證實PXR的配體利福平及其他配體可增強CYP3A4和MDRl表達，前者可代謝50%以上的處方藥，其中也包括部分抗癌藥物。PXR配體具有泛宿主性，一些抗癌藥如紫杉醇、順鉑等也是其配體，可通過PXR誘導(dǎo)MDRl表達，并可被酮康唑抑制〔5〕，這些研究提示PXR與EC9706細胞的抗凋亡調(diào)控相關(guān)。

PXR的表達部位主要在肝臟、小腸、腎臟及血腦屏障等組織細胞，這與經(jīng)其轉(zhuǎn)錄激活的下游靶酶或蛋白如 CYP3A4、CYP2B6、UGT1A1、MDR1等的表達部位基本一致。近年來在眾多腫瘤組織中也發(fā)現(xiàn)了PXR的高表達，研究表明高表達PXR的腫瘤譜已經(jīng)從早期的性激素相關(guān)腫瘤得到了很大范圍的擴展。在結(jié)腸癌〔6〕中也發(fā)現(xiàn)了PXR的表達并證實了與多藥耐藥的相關(guān)性。最近，在食道鱗狀上皮癌組織中，PXR蛋白及mRNA水平均明顯高于正常食道上皮組織〔2〕。

PXR抑制腫瘤細胞凋亡也可能是其誘導(dǎo)耐藥的機制之一。在人結(jié)腸癌細胞中，PXR活化導(dǎo)致了抗凋亡基因，如 BAG3，BIRC 2，MCL-1等表達上調(diào)，而包括BAK1和TP53在內(nèi)的促凋亡基因表達受到抑制〔7〕?？墒荲erma等〔8〕卻發(fā)現(xiàn)了相反的結(jié)果。他們在人乳腺癌細胞系MCF-7和ZR-75-1中發(fā)現(xiàn)，PXR的活化也可以通過一氧化氮(NO)依賴的途徑上調(diào) p53的表達，進而導(dǎo)致促凋亡因子p21、PUMA、BAK表達增加，促進了乳腺癌細胞的凋亡。PXR對細胞凋亡的作用可能和性激素的表達水平及PXR對NO的誘導(dǎo)作用的強弱有關(guān)，具有一定的組織特異性，從而為研究化療藥物的選擇性和與激素類藥物的聯(lián)合用藥方面提供了參考。

本實驗發(fā)現(xiàn)PXR基因與凋亡蛋白Caspase-3在食管鱗癌中的表達明顯相關(guān)，進一步證實其在食管鱗癌的發(fā)生與演進中有著重要的作用與地位，是食管鱗癌治療中的一個靶基因，因此對PXR的研究及應(yīng)用這些研究成果有望使其成為食管鱗癌診斷和基因、免疫治療的新靶點，為食管鱗癌的診斷、治療開辟一條新途徑。本研究證明，藥理學(xué)活化PXR足夠抑制阿霉素誘導(dǎo)的EC9706細胞的凋亡，基因表達分析說明PXR的抗凋亡作用與多種凋亡相關(guān)基因的調(diào)控有關(guān)。PXR作為抗腫瘤細胞凋亡作為在腫瘤的治療新靶點方面已引起重視，本研究為PXR在食管癌中的治療作為新的靶點提供了理論依據(jù)。

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R329

〕 A 〔

1005-9202(2012)22-4962-04;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.22.051

樊青霞(1952-)，女，主任醫(yī)師，主要從事惡性腫瘤研究。

謝晶華(1987-)，女，碩士，主要從事惡性腫瘤研究。

〔2011-12-17收稿 2012-04-05修回〕

(編輯 趙慧玲)