劉 奇 陳德興 趙吉生 (吉林省前衛(wèi)醫(yī)院普外科，吉林 長春 3002)

苯丁酸鈉對胃癌細胞株SGC-7901的增殖抑制作用

劉 奇 陳德興 趙吉生1(吉林省前衛(wèi)醫(yī)院普外科，吉林 長春 130012)

目的 研究苯丁酸鈉(SPB)在體外對胃癌細胞株SGC-7901生長、分化的影響。方法 應用MTT分析法、流式細胞儀、形態(tài)學觀察法對在體外經不同濃度的SPB處理過的SGC-7901細胞進行檢測。結果 SPB能抑制SGC-7901細胞的生長，并且有時間依賴關系及劑量依賴關系;應用流式細胞儀測定發(fā)現(xiàn)，經SPB處理的細胞其S期在16.48%，而未經處理的細胞其S期在31.07%;電子顯微鏡觀察，細胞形態(tài)發(fā)生改變。結論SPB在體外抑制胃癌細胞株SGC-7901的生長，為SPB治療胃腫瘤提供了實驗依據(jù)。

苯丁酸鈉;SGC-7901;生長抑制

苯丁酸鈉(SPB)作為一種誘導分化劑，對多種腫瘤具有誘導分化和殺傷作用，通過抑制組蛋白脫乙?；刚T導腫瘤細胞分化，抑制腫瘤細胞生長，以改變染色質和基因表達。其分化作用已被證明是通過誘導G0/G1終末分化以及誘導與分化有關的細胞周期調節(jié)關鍵點p21WAF1而實現(xiàn)的。SPB在體內經β氧化轉變成苯乙酸鈉(PA)，后者又可與血漿中谷氨酰胺合成苯乙酰谷氨酰胺(PAG)。目前發(fā)現(xiàn)SPB對喉癌、視網膜母細胞瘤、白血病和淋巴瘤、黑色素瘤、肝癌、腦腫瘤均有作用，本文擬探討SPB在體外對胃癌細胞株SGC-7901生長、分化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

細胞培養(yǎng)人胃癌細胞株SGC-7901，購自上海生物制品研究所。培養(yǎng)于含20%小牛血清(FCS)(杭州四季青生物工程材料研究所)的RPMI 1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱37℃，每3～4 d傳代一次，每24 h換液一次。SPB分子式C10H11O2Na，分子量186.2，本品為無色無味固體，RPMI1640培養(yǎng)液配制成儲存液，－20℃保存。本品自晶美生物有限公司。MTT購于華美生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT法測定SPB對SGC-7901細胞的抑制率 將5×104/ml接種于96孔板中，100 μl/孔，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中，常規(guī)培養(yǎng)過夜(細胞完全貼壁)后，加入SPB，20 μl/孔，細胞對照孔加等量無血清培養(yǎng)液代之。各孔補充含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，使終體積為200 μl，每組設6個復孔，另設只加培養(yǎng)液的空白對照組。SPB終濃度分別為0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mmol/L，0 mmol/L作為兩藥的陰性對照組。3 d后每孔加人20 μl MTT，于37℃的CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4 h，棄上清加人150 μl二甲基亞砜(DMSO)，振蕩混勻10 min，使紫藍色沉淀充分溶解，采用全自動酶標儀在波長570 nm處測吸光值(A值)。

1.2.2 流式細胞儀分析 將濃度為1×106/ml的細胞加入6孔培養(yǎng)板，1 ml/孔。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，向各孔內加入受試藥物并置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h消化各組細胞制成單細胞懸液，1 000 r/min離心5 min;PBS洗滌2次，PBS重懸細胞;加入50 μl RNase A(10 g/L)，室溫 下孵育 30 min; 加 入 500 μl 100 mg/L PI染色液(0.01 mol/L PBS溶液，4℃避光保存)，旋轉混勻，置4℃避光孵育30 min;上機測試，軟件分析。

1.2.3 電子顯微鏡觀察SGC-7901細胞超微結構的變化

SGC-7901細胞在25 cm2培養(yǎng)瓶中傳代培養(yǎng)，加入 SPB 4.0 mmol/L此日被視為第0天。用0.25%的胰酶消化，消化前倒置顯微鏡下先拍片。0.25%胰酶消化收集細胞，離心1 500 r/min。離心10 min后取離心管，底部細胞團塊切成約1.5 mm3大小，經 2.5%戊二醛前固定后，乙醇系列脫水，Epon812環(huán)氧樹脂包埋，LKB-Ⅲ型超薄切片機半薄切片定位后做超薄切片，醋酸雙氧鈾及檸檬酸鉛雙重染色，JEM-1200EX型透射電鏡觀察，攝片。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 MTT法測定SPB對SGC-7901細胞生長的抑制作用

胃癌細胞 SGC-7901 經0，0.5，1.0，2.0，4.0，8.0 mmol/L 的 SPB作用24、48、72 h的檢測結果，除了4.0 mmol/L濃度的SPB作用于SGC-7901細胞48 h、72 h兩者之間無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，其他各組均存在統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，即隨著SPB用藥劑量的增加和作用時間的延長，所測得的增殖抑制率升高越明顯。表明SPB對胃癌SGC-7901細胞的增殖呈時間和劑量依賴性抑制作用。見表1。

2.2 流式細胞儀測定細胞周期

4.0 mmol/L SPB作用72 h后G0/G1期明顯增加，S期減少(P＜0.05)。表明SPB抑制了SGC-7901細胞分裂和DNA的合成，細胞周期出現(xiàn)G0/G1期阻滯。見表2。

表1 不同濃度SPB作用后的SGC-7901細胞在不同時間的抑制率(%)

表2 SPB用藥作用72 h對SGC-7901細胞周期的影響(%)

2.3 電子顯微鏡測定SPB對SGC-7901細胞超微結構的影響

圖1 電子顯微鏡檢測SGC-7901細胞超微結構

圖1可見，電子顯微鏡下觀察對照組SGC-7901細胞呈多型性，表面有許多微絨毛，細胞結構完整，細胞核形細胞核較大，核質比明顯增大;有的胃癌細胞核圓形、橢圓形或不規(guī)則形，多個細胞核，核仁明顯;觀察胃癌細胞局部情況發(fā)現(xiàn)細胞質內線粒體豐富，可見粗面內質網和游離核糖體豐富，符合胃癌細胞高增殖的特點。應用SPB 4.0 mmol/L作用72 h后SGC-7901細胞固縮，表面微絨毛消失，可見多個鈍性突起，細胞核不規(guī)則，核內異染色體略增多，核基質輕度改變，糖原顆粒增多，線粒體改變;有些細胞胞質內存在較多空泡;有些細胞局部細胞呈不規(guī)則形改變，核內異染色體增多，胞質改變，空泡增多;一部分細胞呈現(xiàn)空化狀，核圓，核基質空化，細胞質內線粒體和溶酶體腫脹。說明SPB對胃癌細胞株SGC-7901的增殖起了抑制作用。

3 討論

SPB起初發(fā)現(xiàn)可治療新生兒腦病，并可作為一種氨清除劑治療尿素循環(huán)紊亂疾病〔1〕;近年來發(fā)現(xiàn)其可作為一種誘導分化劑，對多種腫瘤具有誘導分化和殺傷作用，但劑量過大對實體腫瘤無效用〔2〕。它的抗腫瘤作用機制主要表現(xiàn)在：(1)PPAR的激活：PPARs屬于核類固醇受體超家族，是一種核內受體轉錄因子，有三種亞型：PPARα、PPARβ和 PPARγ。PPARs激活后可抑制 cyclinD1，cyclinB、cyclinE，CDKIP21蛋白表達，阻滯細胞分裂增殖和CDK4表達，并上調CD-KIP21和P27蛋白表達從而抑制腫瘤細胞生長〔3〕。(2)活化細胞外信號調節(jié)激酶(ERK)和促進激活蛋白-1(AP-1)轉錄：ERK是三種促分裂原激活蛋白激酶(MAPKs)中的一種。MAPK信號傳導通路是典型的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化方式，可以激活ERK。蛋白激酶C(PKC)、ras-GTP可磷酸化激活 Raf-l激酶，后者磷酸化激活MAPK，進而將 MAPK/ERK1激酶(MEKl)和 MEK2激活。MEK1和MEK2的活化則可進一步磷酸化ERK，從而活化其下游的核內轉錄因子AP-1。C-jun是AP-1家族中含有亮氨酸拉鏈結構的轉錄因子，它能與自身或其他家族成員JunD、c-Fos和ATF-2形成二聚體，并與DNA結合位點結合使相關基因轉錄激活〔4〕。(3)抑制p21ras蛋白的異戊烯化及膽固醇的合成，由于膽固醇和異戊二烯是瘤細胞生長所必需的，因而他們合成的減少也對體內腫瘤生長起抑制作用。本文發(fā)現(xiàn)經不同濃度的SPB作用后的SGC-7901細胞，細胞生長抑制表現(xiàn)出明顯的時間劑量依從性，說明SPB具有調節(jié)胃癌SGC-7901細胞的增殖和分化能力，預示在治療胃癌腫瘤方面SPB具有良好的前景。

1 Lee B，Rhead W，Diaz GA，et al.Phase 2 comparison of a novel ammonia scavenging agent with sodium phenylbutyrate in patients with urea cycle disorders：safety，pharmacokinetics and ammonia control〔J〕.Mol Genet Metab，2010;100(3)：221-8.

2 Lin J，Gilbert J，Rudek MA，et al.A phase I dose-finding study of 5-azacytidine in combination with sodium phenylbutyrate in patients with refractory solid tumors〔J〕.J Clin Cancer Res，2009;15(19)：6241-9.

3 潘華鋒，陳孝平.Ciglitazone抑制人肝癌HepG2細胞增殖活性的實驗研〔J〕.中華實驗外科雜志，2004;21(8)：934-6.

4 孫象軍.苯丁酸鈉及二甲基甲酰胺對乳腺癌細胞增殖抑制及誘導分化的實驗研究〔D〕.吉林大學，2007.

R735.2

〕 A

〕 1005-9202(2012)22-4960-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.22.050

1 吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院

劉 奇(1979-)，男，主治醫(yī)師，主要從事肝膽外科疾病的診治研究。

〔2012-01-10收稿 2012-02-10修回〕

(編輯 徐 杰)