李志勇 趙 暉 張 琪 (中央民族大學(xué)中國少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究院，北京 0008)

兩種血管性癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力與海馬自由基代謝的比較

李志勇 趙 暉1張 琪1(中央民族大學(xué)中國少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究院，北京 100081)

目的 觀察兩種擬血管性癡呆(VD)模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬組織自由基代謝變化。方法 采用線栓法和雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎法分別制備大腦中動脈梗死(MCAO)和慢性腦低灌注型(CCA)VD模型，Morris水迷宮檢測癡呆大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，生化法檢測模型大鼠海馬組織中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)的含量變化。結(jié)果 在訓(xùn)練的1～4 d，MCAO模型和CCA模型大鼠逃避潛伏期和游泳路徑延長(P＜0.05，P＜0.01)，CCA模型出現(xiàn)逃避潛伏期和游泳路徑延長的時間早于MCAO模型(P＜0.05，P＜0.01);MCAO模型大鼠的dP/dT和穿環(huán)次數(shù)均明顯減少(P＜0.05，P＜0.01);MCAO模型與CCA模型大鼠海馬組織MDA含量明顯增加，SOD、GSH-Px的含量則明顯下降(P＜0.05，P＜0.01)，兩種模型MDA、SOD、GSH-Px含量變化無顯著差別。結(jié)論 CCA模型大鼠空間記憶能力下降明顯，而MCAO模型記憶保持能力較差，MDA、SOD、GSH-Px代謝參與了MCAO和CCA所致血管性癡呆的病理過程。

血管性癡呆;大腦中動脈線栓;慢性腦低灌注;學(xué)習(xí)記憶功能;谷胱甘肽過氧化物酶;超氧化物歧化酶;丙二醛

血管性癡呆 (VD)是由一系列腦血管因素 (缺血、出血、急慢性缺氧性腦血管病)引起的腦組織血液循環(huán)障礙、腦部機(jī)能減退而致的一種認(rèn)知功能缺損綜合征〔1〕?？煽俊⒎€(wěn)定的VD動物模型是篩選抗VD藥物和研究VD發(fā)病機(jī)制的前提。采用線栓法致大腦中動脈栓塞 (MCAO)或結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈致慢性腦低灌注 (CCA)模擬VD狀態(tài)，是目前常見的VD模型制備方法。本研究分別制備MCAO和CCA VD大鼠模型，比較兩種模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能及海馬組織谷胱甘肽過氧化物酶 (GSH-Px)、超氧化物歧化酶 (SOD)、丙二醛 (MDA)的含量變化，以期了解上述兩種VD模型大鼠的認(rèn)知障礙差異，并分析海馬組織自由基代謝改變與認(rèn)識障礙的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

S D大鼠，雄性，體重240～260 g，北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，合格證號SCXK(京)2004-0005。實驗條件下自然飲食，適應(yīng)環(huán)境3 d后進(jìn)行實驗。

1.2 試劑與儀器

GSH-PX測試盒(批號：20080320)，SOD測試盒(批號：20080320)，MDA測試盒(批號：20080320)及總蛋白測試盒均由(批號：20081320)，南京建成生物工程研究所提供。752N型分光光度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司;TGL-16G型高速臺式離心機(jī)，上海醫(yī)用分析儀器廠;AEG-220電子分析天平，日本Shimadzu公司。

1.3 方法

1.3.1 MCAO與 CCA VD模型的制備 參考文獻(xiàn)〔2〕制備MCAO VD模型。具體方法：大鼠麻醉后將其仰臥固定，分離右頸總動脈(CCA)、頸內(nèi)動脈(ICA)及頸外動脈(ECA)并掛線備用，結(jié)扎ECA與 CCA，用動脈夾夾閉ICA遠(yuǎn)心端后，迅速于ECA與ICA分叉處作一切口，從切口處插入一端加熱成光滑球形的尼龍線(直徑0.265 mm)，置于頸內(nèi)動脈17～18 mm，有輕微阻力感為止，實現(xiàn)大腦中動脈阻塞導(dǎo)致腦缺血。扎緊動脈殘端，尼龍線外留約1 cm，縫合皮膚。2 h后輕輕提拉所留線頭至有阻力，實現(xiàn)大腦中動脈再灌注，則造模完成。動物入選的標(biāo)準(zhǔn)：動物于缺血再灌注2 h后出現(xiàn)對側(cè)前肢卷曲或行走轉(zhuǎn)圈或行走向?qū)?cè)傾倒，無此體征或于2 h后仍不清醒者棄去。參考文獻(xiàn)〔2〕，制備CCA VD模型。具體方法：大鼠麻醉后，仰臥固定，頸正中去毛消毒后，頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動脈，雙重絲線結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈，縫合傷口。假手術(shù)組僅游離雙側(cè)頸總動脈，各組大鼠同條件飼養(yǎng)。

1.3.2 學(xué)習(xí)記憶功能檢測 利用Morris水迷宮對各組大鼠進(jìn)行學(xué)習(xí)記憶能力檢測。圓形水池直徑98 cm、高60 cm，內(nèi)壁涂成黑色，水深30 cm，水溫(21±1)℃，直徑8 cm的平臺隱藏于水面下1 cm處，利用Morris水迷宮行為記錄系統(tǒng)軟件追蹤大鼠在水迷宮中的運動軌跡、潛伏期、游泳速度及路徑長度。實驗過程分為空間參考記憶能力和工作記憶能力測試兩部分。空間參考記憶能力測試時，平臺放在水池西南象限(第Ⅲ象限)正中距池壁22 cm處，水迷宮周圍標(biāo)志物固定，無聲、光、人的干擾，以供大鼠定位平臺。整個實驗過程包括：①隱藏平臺獲得實驗：大鼠入池位置分別為平臺所對及相鄰象限，記錄大鼠在90 s內(nèi)成功進(jìn)駐平臺(找到平臺并滯留5 s)所需時間(即逃避潛伏期)和游泳路徑，如在90 s內(nèi)大鼠不能成功進(jìn)駐平臺，則逃避潛伏期記為90 s，并將大鼠引上平臺停留5 s，引導(dǎo)其學(xué)習(xí)與記憶。每只大鼠每天訓(xùn)練4次，計算每天各組大鼠尋找平臺的逃避潛伏期和游泳路徑平均值;②空間搜索實驗：隱藏平臺獲得實驗結(jié)束后第5天撤除平臺，在平臺相鄰象限將大鼠面向池壁放入水中，在30 s內(nèi)觀察并記錄：以原平臺所在的象限(第Ⅲ象限)作為目標(biāo)區(qū)，測量各組大鼠的平臺象限游泳時間與總游泳時間比值(tP/tT);以原平臺所在的象限(第Ⅲ象限)作為目標(biāo)區(qū)，測量各組大鼠在平臺象限的游泳距離占總游泳距離比值(dP/dT);記錄各組大鼠在水池中穿過原平臺所在位置的次數(shù)，即穿環(huán)次數(shù)。

1.3.3 大鼠海馬組織自由基代謝 學(xué)習(xí)記憶功能檢測后，處死大鼠，取全腦，冰浴上分離大腦海馬組織，Tris-組織蛋白抽提試劑提取組織蛋白抽提液，按試劑盒說明書考馬斯亮藍(lán)法測定缺血腦組織GSH-PX、SOD、MDA的含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠學(xué)習(xí)記憶功能變化

隱藏平臺獲得實驗，在第1～4天CCA模型組大鼠的逃避潛伏期較假手術(shù)組明顯延長(P＜0.05，P＜0.01)，在第2～4天模型組游泳路徑較假手術(shù)組明顯增加(P＜0.01);MCAO模型組大鼠在第3、4天逃避潛伏期較假手術(shù)組明顯增加(P＜0.05，P＜0.01)，在第3天游泳路徑與假手術(shù)組比較有明顯增加(P＜0.01);CCA模型組與MCAO模型組比較，在測試的第2、4天時，CCA模型組大鼠的逃避潛伏期與游泳路徑較MCAO模型組明顯增加(P＜0.05，P＜0.01)。見表1。

空間探索實驗結(jié)果顯示經(jīng)訓(xùn)練后，MCAO模型組dP/dT和穿環(huán)次數(shù)較假手術(shù)組明顯減少(P＜0.05，P＜0.01);CCA模型組與假手術(shù)組大鼠tP/tT、dP/dT與穿環(huán)次數(shù)無統(tǒng)計學(xué)差異;CCA模型組大鼠與MCAO模型組比較，CCA模型組的tP/tT、dP/dT較MCAO模型組明顯減少(P＜0.01)。見表2。

2.2 大鼠海馬自由基代謝變化

MCAO模型組大鼠海馬組織MDA含量明顯升高(P＜0.01)，GSH-Px與SOD含量明顯下降(P＜0.05，P＜0.01);與CCA假手術(shù)組比較，CCA組大鼠海馬組織MDA含量明顯升高(P＜0.01)，而GSH-Px和SOD含量則明顯下降(P＜0.01);MCAO與CCA模型組大鼠海馬組織的MDA、GSH-Px與SOD變化無顯著差別。見表3。

與MCAO假手術(shù)組比較，

表1 大鼠搜尋固定平臺逃避潛伏期和游泳路徑的變化s)

表1 大鼠搜尋固定平臺逃避潛伏期和游泳路徑的變化s)

與假手術(shù)組比較：1)P＜0.05，2)P＜0.01;與 MCAO 組比較：3)P＜0.05，4)P＜0.01

組別 n 潛伏期(s)第1天 第2天 第3天 第4天游泳路徑(cm)第1天 第2天 第3天 第4天MCAO假手術(shù)組 12 45.75±9.55 19.4±7.38 13.2±5.27 11.37±6.62 2 303.7±449.94 943.13±358.65 569.02±226.52 655.44±396.25 MCAO模型組 10 46.49±9.52 22.9±7.76 22.62±13.182)18.77±11.311)2 199.7±434.47 1 136.92±456.331541.10±917.572)919.64±465.43 CCA假手術(shù)組 12 36.2±9.3 17.7±6.6 19.8±10.8 14.7±9.8 1 768.6±397.7 849.7±381.5 897.8±481.6 720.1±484.7 CCA模型組 13 46.0±11.01) 33.0±15.02)3) 34.5±12.72) 29.6±11.22)3) 2 210.0±602.6 1 689.5±584.12)4)1 613.5±583.32)1 381.7±427.02)4)

表2 大鼠空間探索能力的變化(s)

表2 大鼠空間探索能力的變化(s)

與假手術(shù)組比較：1)P＜0.05，2)P＜0.01;與MCAO組比較：3)P＜0.01

組別 n tP/tT(%) dP/dT(%) 穿環(huán)次數(shù)(次)MCAO假手術(shù)組1.04±1.06 12 27.77±6.63 29.93±4.67 1.22±0.67 MCAO模型組 10 27.31±11.48 25.81±12.671)0.55±0.822)CCA假手術(shù)組 12 0.26±0.08 0.23±0.07 1.18±0.08 CCA模型組 13 0.19±0.073) 0.19±0.073)

表3 VD大鼠海馬組織自由基代謝的變化(n=8s)

表3 VD大鼠海馬組織自由基代謝的變化(n=8s)

與假手術(shù)組比較：1)P ＜0.05，2)P ＜0.01

組別 n MDA(nmol/mg)GSH-Px(U/mg)SOD(U/mg)MCAO假手術(shù)組12 1.95±0.60 12.25±2.99 644.9±72.21 MCAO模型組 10 3.10±0.972) 3.23±1.071)385.33±59.432)CCA假手術(shù)組 12 1.97±0.74 9.73±3.55 687.70±119.09 CCA模型組 13 3.30±0.882) 4.17±2.782)415.27±68.872)

3 討論

MCAO和CCA模型是目前常見的VD模型制備方法，兩種模型具有制備方法簡單、缺血灶明確、創(chuàng)傷小、可重復(fù)性強(qiáng)等特點。在病理損傷與學(xué)習(xí)記憶功能改變上，兩種模型各具特點。MCAO模型大鼠的大腦中動脈栓塞側(cè)海馬及皮質(zhì)處于長期低灌注損傷狀態(tài)，除了可導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的腦組織病理性損傷外，同時兼具有模擬動脈粥樣硬化管腔狹窄所致的大腦低灌注學(xué)習(xí)記憶功能下降〔3〕;MCAO模型大鼠有明顯的學(xué)習(xí)記憶障礙，其在Morris水迷宮中學(xué)習(xí)尋找平臺的能力、對平臺在水迷宮中的空間位置記憶均顯著下降。CCA模型大鼠腦血流速度迅速下降，須經(jīng)數(shù)月的代償和適應(yīng)才能恢復(fù)正常，腦血流下降最明顯的部位是皮層和白質(zhì)，海馬次之;CCA模型大鼠的視空間學(xué)習(xí)能力、恐懼閾值和非空間記憶能力均受到損害，其在Morris水迷宮中的游泳時間增加，逃避潛伏期增加，在八臂輻射迷宮中的錯誤次數(shù)增多〔4〕。

Morris水迷宮是用于研究大鼠海馬和腦區(qū)受到損害后學(xué)習(xí)、記憶能力變化的常用儀器，是目前檢測大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的主要手段〔5〕。Morris水迷宮的隱藏平臺獲得實驗通過記錄大鼠每次尋找平臺的逃避潛伏期和游泳路徑，反映大鼠的空間參考記憶獲得能力，逃避潛伏期和游泳路徑越長則說明大鼠的空間位置記憶越差。本研究表明雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎更易導(dǎo)致大鼠空間記憶能力下降。大腦中動脈梗阻導(dǎo)致的擬血管癡呆大鼠的記憶保持能力較差，而雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎對大鼠的空間記憶保持能力影響較小。

現(xiàn)在越來越多的證據(jù)認(rèn)為氧化應(yīng)激參與多種神經(jīng)退行性疾病過程，是導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡和壞死的共同毒理機(jī)制〔6～8〕。本研究顯示，MCAO和CCA模型大鼠活性氧產(chǎn)生過多和(或)抗氧化能力下降，活性氧的清除不足是導(dǎo)致VD大鼠神經(jīng)細(xì)胞損傷、認(rèn)知功能下降的主要病理機(jī)制。

綜上研究，MCAO和CCA兩種模型大鼠均表現(xiàn)出學(xué)習(xí)記憶功能障礙，但CCA模型更易出現(xiàn)空間記憶能力下降，而MCAO模型則在記憶保持方面能力較差，表明兩種動物模型在學(xué)習(xí)記憶功能障礙方面各具特點。兩種模型大鼠海馬組織MDA、SOD、GSH-Px等自由基代謝呈現(xiàn)相同變化趨勢，表明氧自由基代謝參與了MCAO和CCA所致VD的病理過程，是由腦血管病變所致的神經(jīng)退行性病變的共有機(jī)制〔9〕。

1 王 鵬.血管性癡呆的藥物治療進(jìn)展〔J〕.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2007;24(1)：120-2.

2 田金洲.血管性癡呆〔M〕.北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：598-607.

3 尹軍祥，田金洲，黃啟福，等.MCAO擬血管性癡呆大鼠模型的建立〔J〕.中國病理生理雜志.2003;19(8)：1144-7.

4 舒 怡，張 洪，章軍建.慢性腦低灌注的實驗研究進(jìn)展〔J〕.中華腦血管病雜志(電子版)，2010;4(3)：199-206.

5 張均田，張慶柱.神經(jīng)藥理學(xué)研究技術(shù)與方法〔M〕.北京：人民衛(wèi)生出版社，2005：298.

6 Isobe K，Ito S，Haneda M，et al.Cellular and systemic defense system against age-promoting stimuli〔J〕.Nagoya J Med Sci，2006;68(1-2)：9-18.

7 Bosco DA，F(xiàn)owler DM，Zhang Q，et al.Elevated levels of oxidized cholesterol metabolites in Lewy body disease brains accelerate alpha-synuclein fibrilization〔J〕.Nat Chem Biol，2006;2(5)：249-53.

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9 趙保路.自由基、天然抗氧化劑與神經(jīng)退行性疾病〔J〕.生物物理學(xué)報，2010;26(4)：263-74.

Ability of learning and memory and free radical metabolism in hippocampus of two kinds of vascular dementia rats

LI Zhi-Yong，ZHAO Hui，ZHANG Qi.
China Minority Traditional Medical Center of Minzu University of China，Beijing，100081，China

Objective To observe the learning and memory function and the changes of free radical metabolism in hippocampus of two kinds of vascular dementia(VD)rats induced by middle cerebral artery occlusion(MCAO)and common carotid artery(CCA).Methods Rat models with MCAO were established by line embolism method.Rat models with CCA were prepared by a permanent ligation of the bilateral common carotid artery(2-VO).Then，the learning and memory function of rat models were detected by Morris water maze(MWM)，and the content changes of GSH-Px，SOD，MDA in hippocampus of rat models were tested by biochemical method.Results The escape latency and swimming length in the hidden-platform acquisition training with MWM were significantly prolonged in MCAO and CCA models when rats were swimming trained on 1～4 d(P＜0.01 orP＜0.05).The extended escape latency and swimming length were appeared earlier in CCA models than those of MCAO models(P＜0.01 orP＜0.05)，and the dP/dT and crossing circle times were decreased in MCAO models(P ＜0.05，P ＜0.01).The content of MDA was increased，the contents of SOD and GSH-Px were reduced in hippocampus of MCAO and CCA models(P ＜0.05，P ＜0.01).But in the 2 kinds of models，there were not any significant differences in the content changes of MDA，SOD and GSH-Px.Conclusions The spatial memory is decreased significantly in CCA model，and the memory retention is poor in MCAO model.The metabolism of MDA，SOD and GSH-Px contribute to pathological process of VD induced by MCAO and CCA.

Vascular dementia;MCAO;CCA;Learning and memory function;GSH-Px;SOD;MDA

R749

A

1005-9202(2012)22-4940-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.22.040

國家自然科學(xué)基金面上項目(No.30973782);國家自然科學(xué)基金青年基金項目(No.81001693);北京市中醫(yī)藥科技基金資助項目(No.JJ2008-042)

1 首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院

趙 暉(1973-)，女，副教授，博士，主要從事腦血管疾病的基礎(chǔ)研究。

李志勇(1978-)，男，副研究員，博士，主要從事民族藥防治神經(jīng)退行性病的藥效與物質(zhì)基礎(chǔ)研究。

〔2011-10-21收稿 2012-01-10修回〕

(編輯 張永貴/胡國義)