張香桂，倪萬潮，沈新蓮，徐 鵬

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所，江蘇 南京210014）

棉花是常異花授粉作物，利用雜種優(yōu)勢是提高產(chǎn)量和改善品質的重要途徑。中國是世界產(chǎn)棉國中種植雜交棉最多的國家之一，近年來我國轉基因抗蟲雜交棉花在生產(chǎn)上快速發(fā)展，尤以育苗移栽的長江流域棉區(qū)發(fā)展迅速。目前，江蘇省80%以上的棉田種植雜交棉，其中多為轉基因抗蟲雜交棉，其雜交種子主要采用人工制種技術生產(chǎn)。隨著勞動力成本的迅速提高，較高的種子生產(chǎn)成本已成為我國進一步發(fā)展轉基因抗蟲雜交棉的“瓶頸”，而其中用工最多的環(huán)節(jié)則是人工去雄。若不去雄直接授粉，棉花雜交種子的成本將顯著降低。利用棉花高柱頭材料或人為誘導棉花高柱頭，用于棉花雜交制種則可以實現(xiàn)不去雄直接授粉[1，2]，但雜交種子純度往往難以保證。能否采用提前授粉法解決雜交種子的純度問題？所謂提前授粉，就是在棉花自花散粉前已完成授粉甚至受精過程，在生產(chǎn)上就是在開花前的一天或當日早上花苞尚未開放散粉前的時段。而此時段授粉棉花柱頭是否有活性，花粉如何收集與保存，制種效率如何？對棉花花粉貯藏和當日花、隔日花（開花后第2天的花）柱頭活力強弱的變化已有報道[3～5]，而對棉花次日花（第2天開放的花）柱頭是否已成熟，能否接受正常的花粉而結實，則少見報道。同時，在對棉花花粉活性和柱頭活性測定方法上的研究上，對花粉活力的測定方法報道較多，常用的有聯(lián)苯胺-甲耐酚染色法、FDA熒光染色法、液體培養(yǎng)基培養(yǎng)發(fā)芽法、花柱基部花粉管穿透計數(shù)法和醋酸洋紅反應法等，而對棉花柱頭活性的測定多采用田間分時段授粉法[3～5]，費工費時，受花粉活性和外界環(huán)境因素影響大。本文借鑒其他作物柱頭可授性檢測方法，即用聯(lián)苯胺—過氧化氫法測定棉花柱頭的可授性，同時在田間進行授粉驗證，以期探索棉花柱頭活性快速測定方法，為棉花雜交育種和探索新的棉花高效制種技術提供參考?，F(xiàn)將研究結果總結如下：

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 棉花品種：試驗選用陸地棉常規(guī)高產(chǎn)品種（1）蘇棉 9 號、（2）蘇棉 19 號；抗蟲棉品種（1）33B、（2）中植棉 3 號；彩色棉（1）棕絮品系 CP3、（2）綠絮品系 CP4；高品質棉品系（1）1176、（2）1196。

1.1.2 試驗地點：試驗于2010年在江蘇省溧水植物科學基地進行。

1.2 試驗方法

1.2.1 棉花柱頭活性測定方法：采用聯(lián)苯胺—過氧化氫法。聯(lián)苯胺—過氧化氫反應液為1%聯(lián)苯胺溶液、3%過氧化氫溶液、水的體積比為4:11:22的混合液，裝入棕色瓶內(nèi)，放在4℃冰箱保存?zhèn)溆?。試劑配制?%聯(lián)苯胺溶液：稱1 g聯(lián)苯胺固體溶于100 mL50%的酒精，裝入棕色瓶內(nèi)備用；3%過氧化氫溶液：取10 mL30%的過氧化氫和90 mL蒸餾水混合，裝入棕色瓶內(nèi)備用；水：蒸餾水若干。

1.2.2 花粉活性測定方法：采用液體培養(yǎng)基花粉培養(yǎng)法，培養(yǎng)基配方由南京農(nóng)業(yè)大學唐燦明教授提供，培養(yǎng)溫度26℃～28℃。培養(yǎng)方法：在載玻片上滴2滴培養(yǎng)液，取3個花藥放在培養(yǎng)液中,輕柔出花粉，將花藥踢出，加上蓋玻片，放在預先備好的放有少量加水衛(wèi)生紙的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)3 h左右，在顯微鏡下即可觀察到花粉管的萌芽和伸長情況，順著一個方向記數(shù)，計算百分數(shù)。

2 結果與分析

用聯(lián)苯胺—過氧化氫法測定棉花柱頭活性，我們試用了三種操作方法，試驗結果如下：

2.1 第一種操作方法的步驟和測定結果

借用張志良等（2004）的方法，在上午10:00之前，取8個棉花品種的當日花、次日花柱頭各3個，分別放入凹面載玻片中 （即重復3次），用移液槍滴加聯(lián)苯胺—過氧化氫反應液二三滴。觀察其反應，均是切口處有氣泡產(chǎn)生，其他部位很少產(chǎn)生氣泡，柱頭顏色變化不明顯。此法不易區(qū)分棉花柱頭的活性。

2.2 第二種操作方法的步驟和測定結果

在上午10:00之前，取8個棉花品種的當日花、次日花柱頭各3個，將整個待測的柱頭切為3段放入凹面載玻片中，其他操作同上。觀察其反應，待測柱頭均產(chǎn)生較多的氣泡，且傷口處均變藍色。此法不能區(qū)分棉花柱頭的活性。

2.3 第三種操作方法的步驟和測定結果

在上午10:00之前，取8個棉花品種的當日花、次日花柱頭，在離心管上標記，各3個重復。然后依次將柱頭取下，柱頭的頂端朝向離心管底部放入離心管內(nèi)，用移液槍加入聯(lián)苯胺—過氧化氫反應液，直至反應液淹沒全部柱頭，蓋上離心管的蓋子，觀察結果如表1。

表1 棉花柱頭活性測定結果

從表1測定的結果看，（1）不同品種的次日花柱頭顏色變化不明顯，氣泡產(chǎn)生也較少，彩色棉的柱頭幾乎看不到變色。說明不管是什么品種的次日花的柱頭活性都較差；（2）在當日花即當日完全開放花柱頭顏色變化中，抗蟲品種顏色變化快且染色深，高產(chǎn)棉和高品質棉品種柱頭1 h后方可染上色，而彩色棉柱頭顏色變化不及其他品種明顯；而柱頭產(chǎn)生的氣泡（不是傷口處）不同品種完全開放花產(chǎn)生的都較多，而且能夠維持較長的時間。說明不管是什么品種的當日花的柱頭活性都較高。

2.4 田間授粉結果

在室內(nèi)測定柱頭活性的同時，田間分不同時段進行授粉，所使用的母本品種為蘇棉9號，父本品種為33B。次日花授粉的花粉為上午取粉，存放在自己設計的授粉器中放入冰箱保存，使用時取出田間授粉，同時取少量測定花粉活性。花粉活性測定采用 “液體培養(yǎng)基花粉培養(yǎng)法”，以免因花粉活性差而影響試驗結果。次日花授粉的，邊去雄邊授粉，授粉后套管隔離；當日花授粉的花朵，在前一天人工去雄，去雄后套管隔離，每處理授粉50朵花，授粉后套管隔離。調查成鈴和結籽情況，結果如表2。

由表2可以看出，人工去雄后早上6：10授粉，花粉貯藏20 h以上，測定所使用的花粉活性在50%以上，但成鈴率極低，僅為8%，是花粉活性不足還是柱頭可授性影響，有待進一步試驗。從15：40到19：00不同時段提前授粉，成鈴率在40%～56%，且隨著時間的推移成鈴率有逐漸提高的趨勢，但單鈴健籽數(shù)都很少，最高僅在10.00個/鈴。提前授粉單鈴健籽數(shù)少，與室內(nèi)棉花柱頭活性測定結果相一致，即柱頭尚未達生理成熟可能是其主要原因。

表2 田間授粉成鈴情況調查結果

3 討論

在棉花雜交育種和利用雜種優(yōu)勢大量生產(chǎn)棉花雜交種子的過程中，提高雜交成鈴率和單鈴健籽數(shù)具有重要的現(xiàn)實意義。棉花雜交結實率的高低決定于花粉的活性和柱頭的可授性。研究棉花花粉活性的保存方法和柱頭可授性的變化，可為提高制種工效及探索新的制種途徑提供技術參考。

（1）本研究采用聯(lián)苯胺一過氧化氫反應液漫過柱頭法測定棉花柱頭的活性，表現(xiàn)為活性高的柱頭，整個柱頭變藍黑色且充滿氣泡，并能保持較長時間；無活性柱頭產(chǎn)生氣泡少且柱頭始終不變色。在觀察顏色變化時，要注意柱頭和剪下柱頭的傷口處的不同，傷口處變色并不能代表是柱頭變色，不能用來證明柱頭具有可授性。此法可較清晰地區(qū)分棉花柱頭的活性。

（2）采用聯(lián)苯胺一過氧化氫反應液漫過柱頭法測定棉花當日花和次日花柱頭的活性，表現(xiàn)為當日花柱頭變色明顯，產(chǎn)生的氣泡多，田間授粉成鈴率高，單鈴健籽數(shù)多；次日花柱頭變色不明顯，產(chǎn)生的氣泡少甚至無氣泡產(chǎn)生，田間授粉成鈴率雖較高，但單鈴健籽數(shù)少。在花粉采用冷藏，授粉時測定花粉活力，基本排除花粉影響田間雜交結實因素的情況下，室內(nèi)測定與田間授粉結果相一致，說明采用聯(lián)苯胺一過氧化氫反應液漫過柱頭法測定棉花柱頭活性的方法是可靠的。

（3）本試驗研究表明，棉花次日花柱頭活性尚未達完全的生理成熟，雖能接受正?；ǚ凼芫Y實，但結實性差。利用棉花高柱頭材料或人工誘導棉花高柱頭材料進行雜交制種，為保證種子純度，若采用提前授粉，須探索活化棉花柱頭活性的方法。

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