李 婷，王建龍

(1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長(zhǎng)沙410128;2作物基因工程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長(zhǎng)沙410128;3湖南金健種業(yè)有限公司，常德415000)

水稻(Oryza sativa)屬于世界上最重要的糧食作物之一，全世界有50%以上人口的主食都是水稻。由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病是水稻最嚴(yán)重的病害之一。據(jù)研究統(tǒng)計(jì)，稻瘟病使全球每年水稻產(chǎn)量損失大概占總產(chǎn)量的10% ～15%，造成經(jīng)濟(jì)損失達(dá)數(shù)10億美元[1]。中國(guó)是世界人口最多的國(guó)家，也是水稻種植面積最大的國(guó)家，稻瘟病每年都有不同程度的發(fā)生，特別是近幾年，在西南、長(zhǎng)江中游和東北等幾大水稻種植區(qū)持續(xù)發(fā)生，年發(fā)病面積達(dá)330萬(wàn)～570萬(wàn)hm2，產(chǎn)量損失達(dá)數(shù)億公斤，給我國(guó)糧食安全帶來(lái)了巨大隱患[2]。

生產(chǎn)上一般運(yùn)用農(nóng)藥防治和培育抗稻瘟病的品種來(lái)控制稻瘟病的發(fā)生，但兩種方法都有一定的局限性:農(nóng)藥對(duì)環(huán)境污染大，費(fèi)用高，長(zhǎng)期使用會(huì)導(dǎo)致稻瘟病菌產(chǎn)生抗藥性;由于稻瘟病菌生理小種組成復(fù)雜多變，致病性變異頻繁，含有單一抗性基因的抗病品種在種植3～5年后往往會(huì)喪失抗性。因此，為了實(shí)現(xiàn)經(jīng)濟(jì)節(jié)約和環(huán)境友好型且穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)型的綠色種植，探索新型的廣譜抗瘟基因和主效QTL，采用聚合育種等方法，選育出穩(wěn)定、持久、廣譜的水稻抗性品種，是目前防治稻瘟病最經(jīng)濟(jì)有效的方法。不斷挖掘新的抗性資源，鑒定新的抗瘟基因，尤其是從地方品種中發(fā)掘具有持久抗性的資源對(duì)水稻抗稻瘟病育種具有很重要意義。

1 抗病基因的結(jié)構(gòu)

在過(guò)去的數(shù)十年間，已經(jīng)有超過(guò)100個(gè)植物抗病基因得到克隆，通過(guò)分析它們的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)一些保守基序存在高度的同源性。例如NBS(nucleotidebindingsite)結(jié)構(gòu)域、LRR(leucine rich repeat)結(jié)構(gòu)域、TIR(toll interleukin－1 receptor)結(jié)構(gòu)域、CC 結(jié)構(gòu)域(coiled－coil)、TM(trans membrane)結(jié)構(gòu)域、KIN(kinase)結(jié)構(gòu)域、LZ(leucine zopper)結(jié)構(gòu)域等。根據(jù)這些特點(diǎn)，人們把抗病基因分成四類:NBSLRR，RLK，LRR－TM 和 TM －CC。在這 4類中，NBS－LRR是其中最大的一類，在水稻中將近有500個(gè)這樣的基因。目前已經(jīng)有22個(gè)稻瘟病抗性基因被克隆，除了Pid－2和Pi21外，其余基因均編碼具有NBS－LRR保守結(jié)構(gòu)域的蛋白。

NBS是NBS－LRR結(jié)構(gòu)域中最保守的部分，由激酶1a(kinase－1a)或磷酸結(jié)合環(huán)(p－loop)，激酶2(kinase－2)和激酶3a(kinase－3a)3個(gè)結(jié)構(gòu)組成。LRR結(jié)構(gòu)域因亮氨酸在結(jié)構(gòu)中呈規(guī)律性的重復(fù)而命名。每個(gè)LRR的結(jié)構(gòu)模式相對(duì)很不規(guī)則，多樣性高，基本結(jié)構(gòu)為L(zhǎng)XXLXXLXXLXLXXXX。

2 水稻抗稻瘟病基因的鑒定及定位

稻瘟病抗性的遺傳分析工作最早可以追溯到1922年，但并沒有同步進(jìn)行水稻品種抗稻瘟病基因的系統(tǒng)分析研究。20世紀(jì)60～80年代中期，日本學(xué)者Kiyosawad等對(duì)水稻品種抗稻瘟病基因深入研究分析，鑒定了最開始的14個(gè)主效抗稻瘟病基因(Pita，Pita2，Pik，Pikp，Piks，Pikm，Pikh，Piz，Pizt，Pia，Pib，Pish，Pii，Pit)，并組成了一套鑒定抗稻瘟病基因分析用的體系(JCD)，每個(gè)JDC只攜帶一個(gè)稻瘟病抗性基因[3]。隨后，國(guó)際水稻所(IRRI，International Rice Research Institute)，中國(guó)和韓國(guó)等主產(chǎn)稻國(guó)家，借助日本的JDCs，也逐漸開展了關(guān)于水稻稻瘟病抗性遺傳的系統(tǒng)性研究，并應(yīng)用自己建立的近等基因系或篩選的抗源材料，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一批抗病新基因[4]。至今已有超過(guò)85個(gè)抗稻瘟病基因[5]和350個(gè)QTL[6]被報(bào)道，分布在除第3號(hào)染色體外的 11 條染色體上[7]，除了 Pi21，Pi34，Pi35，Pb1，Pif，Pikur1，Pikur2，Pi－se1 屬于部分抗性基因外，其他都是主效基因(表1)。

表1 已鑒定和定位的水稻稻瘟病抗性基因Table 1 Summary of blast resistance genes identified and mapped in rice

有趣的是，許多抗性基因都成簇分布在水稻的染色體上，特別是在第6，11，12號(hào)染色體上表現(xiàn)尤為明顯。6號(hào)染色體上至少有14個(gè)基因(Pi2，Piz，Piz－t，Pi8，Piz－5，Pi9，Pi13，Pi13，Pi25，Pi26，Pi27，Pigm，Pid2和Pi40)被定位在著絲粒附近的區(qū)域內(nèi)，其中已經(jīng)被成功分離的Piz－t，Pi2和Pi9位于相同的區(qū)域。Pi9[8]是該位點(diǎn)上第一個(gè)被克隆的基因，也是已克隆的基因中抗譜最廣的。最近一個(gè)新的抗瘟基因Pi50(t)，也被定位在該區(qū)域[9]。研究發(fā)現(xiàn)，該區(qū)域由多個(gè)串聯(lián)的NBS－LRR結(jié)構(gòu)組成[10]。在水稻第11號(hào)染色體長(zhǎng)臂端，至少存在9個(gè)水稻抗瘟基因(Pi1，Pi7，Pi18，Pi34，Pi38，Pi44，Pik － m，Pif，Pilm2)和Pik基因的6個(gè)等位基因位點(diǎn)(Pik，Piks，Pik－p，Pik－m，Pik－h(huán)，Pik－g)，其中，Pikm 已經(jīng)利用圖位克隆分離[11]。在第12號(hào)染色體著絲點(diǎn)附近的區(qū)域內(nèi)，至少含有16個(gè)抗瘟基因(Pita，Pita－2，Pitq6，Pi6，Pi12，Pi19，Pi20，Pi21，Pi24，Pi31，Pi32，Pi39，Pi62，Pi157，Pita － 2，Pita)。Monosi[12]通過(guò)對(duì)水稻NBS－LRR結(jié)構(gòu)域的全基因組圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行研究，表明上述3個(gè)水稻抗瘟基因簇內(nèi)含有大量的NBS－LRR結(jié)構(gòu)域。

Pi5[13]被定位于水稻第9號(hào)染色體，抗性供體為RIL260。在溫室人工接種條件下，對(duì) PO6－6等5個(gè)稻瘟病菌小種表現(xiàn)完全高抗性。通過(guò)功能互補(bǔ)驗(yàn)證與基因測(cè)序，發(fā)現(xiàn)該基因與另一個(gè)主效抗瘟基因Pik－m[14]結(jié)構(gòu)相似，也由兩個(gè)獨(dú)立遺傳的NBS－LRR類基因(Pi5－1和Pi5－2)共同起作用，并且這2個(gè)基因的蛋白產(chǎn)物在氨基端都存在著CC結(jié)構(gòu)。通過(guò)基因表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)其中Pi5－1是受病原菌誘導(dǎo)表達(dá)，Pi5－2是組成型表達(dá)[15]。序列分析發(fā)現(xiàn)Pi5－1有5個(gè)外顯子，蛋白產(chǎn)物含有1 025個(gè)氨基酸;Pi5－2含有6個(gè)外顯子，編碼1 063個(gè)氨基酸。

3 水稻抗稻瘟病基因的克隆

隨著水稻基因組測(cè)序的完成和分子生物技術(shù)的迅速發(fā)展，越來(lái)越多的水稻抗瘟基因被定位和克隆，為水稻抗病基礎(chǔ)研究和育種工程打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)[16]。其中，在已鑒定的主效抗瘟基因中，已有22個(gè)基因通過(guò)圖位克隆、電子克隆，或轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽等各種方法被成功克隆(表2)。

表2 已克隆的稻瘟病抗性基因Table 2 Cloned rice blast resistance genes

在上述已被克隆的抗瘟基因中，有20個(gè)為主效基因(Pib、Pita、Pi9、Pi2、Piz － t、Pid2、Pi36、Pi37、Pikm、Pit、Pi5、Pid3(Pi25)、Pikh(Pi54)、Pish、Pik、Pia、Pikp、Pi54rh)，2 個(gè)為主效 QTL(Pb1、Pi21)。分析這22個(gè)已經(jīng)被克隆的抗瘟基因，除了Pid－2和Pi21外，其他20個(gè)基因都編碼具有核苷酸結(jié)合位點(diǎn)(NBS)和富含亮氨酸重復(fù)(LRR)保守結(jié)構(gòu)域的蛋白。

Pi－b[17]是第一個(gè)被克隆出來(lái)的抗瘟基因，抗性供體是BL1，定位于水稻第2號(hào)染色體長(zhǎng)臂端。該基因?qū)θ毡镜亩鄶?shù)稻瘟病菌生理小種表現(xiàn)抗性。Pi－b由229 bp的3'－UTR和4個(gè)內(nèi)含子(163，810，1340，308 bp)的 ORF 等結(jié)構(gòu)組成，它編碼一個(gè)NBS－LRR類蛋白產(chǎn)物，該產(chǎn)物由1 251個(gè)氨基酸所組成。此外，Pi－b基因蛋白的LRR結(jié)構(gòu)域由17個(gè)不完整的LRR組成，結(jié)構(gòu)域的中部又有8個(gè)成簇的半胱氨酸殘基，且單個(gè)重復(fù)的氨基酸的數(shù)目在19～29個(gè)不等。研究表明，該基因的表達(dá)受環(huán)境的影響，如溫度、光照以及水楊酸、茉莉酸、乙烯等條件的改變都會(huì)影響其表達(dá)。

Pi54rh[18]是一個(gè)最新從野生稻中發(fā)現(xiàn)并克隆的廣譜抗瘟基因，同樣屬于CC－NBS－LRR家族，它含有一個(gè)特殊的鋅指結(jié)構(gòu)域。Pi9[8]，被定為于6號(hào)染色體上，與 Pi2、Piz－t、Piz互為等位基因。通過(guò)抗譜鑒定，該基因?qū)?lái)自13個(gè)國(guó)家和地區(qū)的43個(gè)稻瘟病生理小種表現(xiàn)高抗，而Pi2對(duì)其中的36個(gè)稻瘟病生理小種表現(xiàn)高抗。Pi21[19]為表現(xiàn)部分抗性的主效QTL，是目前唯一一個(gè)隱形基因，被定位在第12號(hào)染色體上，抗性供體為Suweon 365，它能編碼富含脯氨酸的蛋白(proline－rich protein)，包括在蛋白的N端具有重金屬結(jié)合域(heavy metal associated domian)以及蛋白互作的基序(motif)。Pb1[20]的抗性供體為秈稻品種Modan，是目前唯一一個(gè)抗穗頸瘟的主效QTL，該基因的抗性強(qiáng)弱與表達(dá)水平高低有關(guān)，基因編碼CC－NBS－LRR蛋白，含有1 296個(gè)氨基酸。

4 分子標(biāo)記技術(shù)在稻瘟病抗性基因研究及水稻抗病育種中的應(yīng)用

與稻瘟病抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記對(duì)抗源的有效應(yīng)用極為重要，同時(shí)也是圖位克隆該基因的基礎(chǔ)和前提。第一代分子標(biāo)記是基于DNA雜交技術(shù)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記，如限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分子標(biāo)記(restriction fragment length polymorphism，RFLP)。RFLP是應(yīng)用最早的分子標(biāo)記技術(shù)，廣泛應(yīng)用于早期抗病基因定位工作中。20世紀(jì)80年代，McCouch等利用135個(gè)RFLP分子標(biāo)記構(gòu)建了一張覆蓋水稻12條染色體，共1 389 cM的遺傳圖譜[21]。但由于RFLP對(duì)DNA的需求量大，操作復(fù)雜，費(fèi)用昂貴，分析速度慢，同位素檢測(cè)對(duì)人體有害等缺點(diǎn)，在大規(guī)模應(yīng)用中受到限制。在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)發(fā)明以后(1987年，Mullis和Faloona)，因其操作比較簡(jiǎn)單，成功率較高，后期涌現(xiàn)了一大批以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)[22]，如簡(jiǎn)單序列重復(fù)分子標(biāo)記(simple sequence repeat，SSR)。由于SSR具有重復(fù)性高，品種間多態(tài)性豐富，可靠性高，快速簡(jiǎn)便，對(duì)DNA質(zhì)量要求不高等諸多優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用到基因定位等相關(guān)領(lǐng)域。隨著測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展，越來(lái)越多的物種的基因組測(cè)序完成，分子標(biāo)記技術(shù)也得到了不斷的提高和完善。如今，不僅核基因組的衛(wèi)星DNA被廣泛用于分子標(biāo)記來(lái)檢測(cè)遺傳多樣性，一些其他細(xì)胞器的衛(wèi)星DNA也用來(lái)作為分子標(biāo)記，例如，葉綠體衛(wèi)星 DNA[23]，線粒體衛(wèi)星 DNA[24]等。

Pi40[25]是一個(gè)抗譜很廣的稻瘟病抗性基因，來(lái)源于水稻品種IR65482－4－136－2－2，被定位于標(biāo)記S2539和RM3330之間的70 kb的區(qū)域[26]。該基因?qū)?lái)自于韓國(guó)、菲律賓的多個(gè)稻瘟病菌小種都表現(xiàn)抗性。Pi35能解釋69.4%表型變異的QTL，被Ngugen等成功定位于1號(hào)染色體SSR標(biāo)記RM1216和RM1003之間的3.5 cM 內(nèi)。Liu[27]等綜合應(yīng)用SSR和RFLP兩種分子標(biāo)記技術(shù)從三黃占2號(hào)中定位了控制病斑葉面積60.3%的變異的5個(gè)抗瘟性QTLs。Miyamoto[28]等對(duì)抗稻瘟病基因 Pi－ b 進(jìn)行了精細(xì)地位，該基因位于12號(hào)染色體長(zhǎng)臂，標(biāo)記RZ123和RAPD標(biāo)記b－1共分離。Pid3是未經(jīng)定位直接利用Nipponbare中的假基因設(shè)計(jì)分子標(biāo)記，通過(guò)得到與感病表型共分離的分子標(biāo)記，而獲得的一個(gè)抗瘟基因[29]。

傳統(tǒng)的水稻抗性育種主要通過(guò)鑒定抗性和選擇表型來(lái)實(shí)現(xiàn)，包括人為創(chuàng)造的增壓選擇，這些都要求育種家具備豐富的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，并且所花費(fèi)的時(shí)間較長(zhǎng)，效率相對(duì)低，外界環(huán)境對(duì)其影響較大。隨著分子標(biāo)記輔助育種(MAS)的發(fā)展，通過(guò)利用與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行間接選擇，加快了分析速度且操作簡(jiǎn)便。研究表明，當(dāng)分子標(biāo)記距離目的基因的遺傳距離小于5 cM時(shí)，能選擇到含有目的基因的植株的正確率在99.75%以上[30]。

5 問題與展望

(1)已有稻瘟病抗性基因研究大都集中在幾個(gè)大的基因簇上，如Pi9和Pik基因家族，這些基因家族在不同的水稻品種中含類似等位的抗性基因，但是存在抗譜差異。通過(guò)對(duì)表現(xiàn)高抗的水稻品種的抗性基因進(jìn)行同源克隆和功能鑒定，可在育種過(guò)程中發(fā)現(xiàn)新的抗性基因。稻瘟病抗性材料與感病材料中的等位基因可能只是一個(gè)或幾個(gè)氨基酸的不同，且稻瘟病抗性材料中的抗性基因往往含有多個(gè)候選基因，如Pi9和Pi50。除了功能基因外，其余都是假基因，它們之間有著復(fù)雜的進(jìn)化關(guān)系，一般認(rèn)為這是進(jìn)化過(guò)程中的抗性基因通過(guò)重組、缺失、點(diǎn)突變或串聯(lián)重復(fù)形成的，闡明這些進(jìn)化關(guān)系，可能提供新的發(fā)掘稻瘟病抗性基因的途徑。

(2)轉(zhuǎn)基因技術(shù)被稱為第二次“綠色革命”[31]，這場(chǎng)技術(shù)革命將可能使全球農(nóng)業(yè)發(fā)生深刻的變革。同樣，轉(zhuǎn)基因技術(shù)也將用于植物抗病研究中，如多基因聚合等。2008年起，國(guó)家及各地已陸續(xù)啟動(dòng)了水稻轉(zhuǎn)基因抗病分子育種重大專項(xiàng)，這樣更加快了水稻抗稻瘟病基因的研究與應(yīng)用的步伐。但是，目前的植物抗病基因研究存在一些問題，如轉(zhuǎn)基因多拷貝誘發(fā)的基因沉默和轉(zhuǎn)基因體系多代后外源基因丟失，轉(zhuǎn)基因植物環(huán)境釋放的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估等問題引起了廣泛的爭(zhēng)議。

(3)通過(guò)常規(guī)育種或分子育種等手段將多個(gè)基因轉(zhuǎn)育到同一品種中，這種方法稱為基因聚合。在稻瘟病抗性育種中，也廣泛采用了這種方法。劉士平等研究表明，基因聚合后抗譜增寬，抗性增強(qiáng)，說(shuō)明基因聚合是培育稻瘟病持久抗性品種的有效方法[32]。

因?yàn)樗镜疚敛【硇》N的高度復(fù)雜和頻繁變異，注定了稻瘟病的長(zhǎng)期存在。為了減少稻瘟病帶來(lái)的產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)損失，必須發(fā)掘和鑒定更多的抗稻瘟病基因，并研究在育種和栽培過(guò)程中怎樣合理利用它們，如及時(shí)了解當(dāng)?shù)氐疚敛∩砭旱膭?dòng)態(tài)變化，科學(xué)更替水稻抗病新品種，最大限度地延長(zhǎng)水稻品種抗性;準(zhǔn)確預(yù)測(cè)稻瘟病生理菌群結(jié)構(gòu)的變化，篩選合適的主效抗瘟基因，并搭配多個(gè)微效基因，選育出攜帶多個(gè)基因的聚合系水稻品種，進(jìn)而提高抗性。

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