李 婷，王建龍

(1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長沙410128;2作物基因工程湖南省重點實驗室，湖南長沙410128;3湖南金健種業(yè)有限公司，常德415000)

水稻(Oryza sativa)屬于世界上最重要的糧食作物之一，全世界有50%以上人口的主食都是水稻。由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病是水稻最嚴重的病害之一。據(jù)研究統(tǒng)計，稻瘟病使全球每年水稻產(chǎn)量損失大概占總產(chǎn)量的10% ～15%，造成經(jīng)濟損失達數(shù)10億美元[1]。中國是世界人口最多的國家，也是水稻種植面積最大的國家，稻瘟病每年都有不同程度的發(fā)生，特別是近幾年，在西南、長江中游和東北等幾大水稻種植區(qū)持續(xù)發(fā)生，年發(fā)病面積達330萬～570萬hm2，產(chǎn)量損失達數(shù)億公斤，給我國糧食安全帶來了巨大隱患[2]。

生產(chǎn)上一般運用農(nóng)藥防治和培育抗稻瘟病的品種來控制稻瘟病的發(fā)生，但兩種方法都有一定的局限性:農(nóng)藥對環(huán)境污染大，費用高，長期使用會導(dǎo)致稻瘟病菌產(chǎn)生抗藥性;由于稻瘟病菌生理小種組成復(fù)雜多變，致病性變異頻繁，含有單一抗性基因的抗病品種在種植3～5年后往往會喪失抗性。因此，為了實現(xiàn)經(jīng)濟節(jié)約和環(huán)境友好型且穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)型的綠色種植，探索新型的廣譜抗瘟基因和主效QTL，采用聚合育種等方法，選育出穩(wěn)定、持久、廣譜的水稻抗性品種，是目前防治稻瘟病最經(jīng)濟有效的方法。不斷挖掘新的抗性資源，鑒定新的抗瘟基因，尤其是從地方品種中發(fā)掘具有持久抗性的資源對水稻抗稻瘟病育種具有很重要意義。

1 抗病基因的結(jié)構(gòu)

在過去的數(shù)十年間，已經(jīng)有超過100個植物抗病基因得到克隆，通過分析它們的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)一些保守基序存在高度的同源性。例如NBS(nucleotidebindingsite)結(jié)構(gòu)域、LRR(leucine rich repeat)結(jié)構(gòu)域、TIR(toll interleukin－1 receptor)結(jié)構(gòu)域、CC 結(jié)構(gòu)域(coiled－coil)、TM(trans membrane)結(jié)構(gòu)域、KIN(kinase)結(jié)構(gòu)域、LZ(leucine zopper)結(jié)構(gòu)域等。根據(jù)這些特點，人們把抗病基因分成四類:NBSLRR，RLK，LRR－TM 和 TM －CC。在這 4類中，NBS－LRR是其中最大的一類，在水稻中將近有500個這樣的基因。目前已經(jīng)有22個稻瘟病抗性基因被克隆，除了Pid－2和Pi21外，其余基因均編碼具有NBS－LRR保守結(jié)構(gòu)域的蛋白。

NBS是NBS－LRR結(jié)構(gòu)域中最保守的部分，由激酶1a(kinase－1a)或磷酸結(jié)合環(huán)(p－loop)，激酶2(kinase－2)和激酶3a(kinase－3a)3個結(jié)構(gòu)組成。LRR結(jié)構(gòu)域因亮氨酸在結(jié)構(gòu)中呈規(guī)律性的重復(fù)而命名。每個LRR的結(jié)構(gòu)模式相對很不規(guī)則，多樣性高，基本結(jié)構(gòu)為LXXLXXLXXLXLXXXX。

2 水稻抗稻瘟病基因的鑒定及定位

稻瘟病抗性的遺傳分析工作最早可以追溯到1922年，但并沒有同步進行水稻品種抗稻瘟病基因的系統(tǒng)分析研究。20世紀60～80年代中期，日本學(xué)者Kiyosawad等對水稻品種抗稻瘟病基因深入研究分析，鑒定了最開始的14個主效抗稻瘟病基因(Pita，Pita2，Pik，Pikp，Piks，Pikm，Pikh，Piz，Pizt，Pia，Pib，Pish，Pii，Pit)，并組成了一套鑒定抗稻瘟病基因分析用的體系(JCD)，每個JDC只攜帶一個稻瘟病抗性基因[3]。隨后，國際水稻所(IRRI，International Rice Research Institute)，中國和韓國等主產(chǎn)稻國家，借助日本的JDCs，也逐漸開展了關(guān)于水稻稻瘟病抗性遺傳的系統(tǒng)性研究，并應(yīng)用自己建立的近等基因系或篩選的抗源材料，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一批抗病新基因[4]。至今已有超過85個抗稻瘟病基因[5]和350個QTL[6]被報道，分布在除第3號染色體外的 11 條染色體上[7]，除了 Pi21，Pi34，Pi35，Pb1，Pif，Pikur1，Pikur2，Pi－se1 屬于部分抗性基因外，其他都是主效基因(表1)。

表1 已鑒定和定位的水稻稻瘟病抗性基因Table 1 Summary of blast resistance genes identified and mapped in rice

有趣的是，許多抗性基因都成簇分布在水稻的染色體上，特別是在第6，11，12號染色體上表現(xiàn)尤為明顯。6號染色體上至少有14個基因(Pi2，Piz，Piz－t，Pi8，Piz－5，Pi9，Pi13，Pi13，Pi25，Pi26，Pi27，Pigm，Pid2和Pi40)被定位在著絲粒附近的區(qū)域內(nèi)，其中已經(jīng)被成功分離的Piz－t，Pi2和Pi9位于相同的區(qū)域。Pi9[8]是該位點上第一個被克隆的基因，也是已克隆的基因中抗譜最廣的。最近一個新的抗瘟基因Pi50(t)，也被定位在該區(qū)域[9]。研究發(fā)現(xiàn)，該區(qū)域由多個串聯(lián)的NBS－LRR結(jié)構(gòu)組成[10]。在水稻第11號染色體長臂端，至少存在9個水稻抗瘟基因(Pi1，Pi7，Pi18，Pi34，Pi38，Pi44，Pik － m，Pif，Pilm2)和Pik基因的6個等位基因位點(Pik，Piks，Pik－p，Pik－m，Pik－h(huán)，Pik－g)，其中，Pikm 已經(jīng)利用圖位克隆分離[11]。在第12號染色體著絲點附近的區(qū)域內(nèi)，至少含有16個抗瘟基因(Pita，Pita－2，Pitq6，Pi6，Pi12，Pi19，Pi20，Pi21，Pi24，Pi31，Pi32，Pi39，Pi62，Pi157，Pita － 2，Pita)。Monosi[12]通過對水稻NBS－LRR結(jié)構(gòu)域的全基因組圖譜數(shù)據(jù)進行研究，表明上述3個水稻抗瘟基因簇內(nèi)含有大量的NBS－LRR結(jié)構(gòu)域。

Pi5[13]被定位于水稻第9號染色體，抗性供體為RIL260。在溫室人工接種條件下，對 PO6－6等5個稻瘟病菌小種表現(xiàn)完全高抗性。通過功能互補驗證與基因測序，發(fā)現(xiàn)該基因與另一個主效抗瘟基因Pik－m[14]結(jié)構(gòu)相似，也由兩個獨立遺傳的NBS－LRR類基因(Pi5－1和Pi5－2)共同起作用，并且這2個基因的蛋白產(chǎn)物在氨基端都存在著CC結(jié)構(gòu)。通過基因表達分析，發(fā)現(xiàn)其中Pi5－1是受病原菌誘導(dǎo)表達，Pi5－2是組成型表達[15]。序列分析發(fā)現(xiàn)Pi5－1有5個外顯子，蛋白產(chǎn)物含有1 025個氨基酸;Pi5－2含有6個外顯子，編碼1 063個氨基酸。

3 水稻抗稻瘟病基因的克隆

隨著水稻基因組測序的完成和分子生物技術(shù)的迅速發(fā)展，越來越多的水稻抗瘟基因被定位和克隆，為水稻抗病基礎(chǔ)研究和育種工程打下了堅實的基礎(chǔ)[16]。其中，在已鑒定的主效抗瘟基因中，已有22個基因通過圖位克隆、電子克隆，或轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽等各種方法被成功克隆(表2)。

表2 已克隆的稻瘟病抗性基因Table 2 Cloned rice blast resistance genes

在上述已被克隆的抗瘟基因中，有20個為主效基因(Pib、Pita、Pi9、Pi2、Piz － t、Pid2、Pi36、Pi37、Pikm、Pit、Pi5、Pid3(Pi25)、Pikh(Pi54)、Pish、Pik、Pia、Pikp、Pi54rh)，2 個為主效 QTL(Pb1、Pi21)。分析這22個已經(jīng)被克隆的抗瘟基因，除了Pid－2和Pi21外，其他20個基因都編碼具有核苷酸結(jié)合位點(NBS)和富含亮氨酸重復(fù)(LRR)保守結(jié)構(gòu)域的蛋白。

Pi－b[17]是第一個被克隆出來的抗瘟基因，抗性供體是BL1，定位于水稻第2號染色體長臂端。該基因?qū)θ毡镜亩鄶?shù)稻瘟病菌生理小種表現(xiàn)抗性。Pi－b由229 bp的3'－UTR和4個內(nèi)含子(163，810，1340，308 bp)的 ORF 等結(jié)構(gòu)組成，它編碼一個NBS－LRR類蛋白產(chǎn)物，該產(chǎn)物由1 251個氨基酸所組成。此外，Pi－b基因蛋白的LRR結(jié)構(gòu)域由17個不完整的LRR組成，結(jié)構(gòu)域的中部又有8個成簇的半胱氨酸殘基，且單個重復(fù)的氨基酸的數(shù)目在19～29個不等。研究表明，該基因的表達受環(huán)境的影響，如溫度、光照以及水楊酸、茉莉酸、乙烯等條件的改變都會影響其表達。

Pi54rh[18]是一個最新從野生稻中發(fā)現(xiàn)并克隆的廣譜抗瘟基因，同樣屬于CC－NBS－LRR家族，它含有一個特殊的鋅指結(jié)構(gòu)域。Pi9[8]，被定為于6號染色體上，與 Pi2、Piz－t、Piz互為等位基因。通過抗譜鑒定，該基因?qū)碜?3個國家和地區(qū)的43個稻瘟病生理小種表現(xiàn)高抗，而Pi2對其中的36個稻瘟病生理小種表現(xiàn)高抗。Pi21[19]為表現(xiàn)部分抗性的主效QTL，是目前唯一一個隱形基因，被定位在第12號染色體上，抗性供體為Suweon 365，它能編碼富含脯氨酸的蛋白(proline－rich protein)，包括在蛋白的N端具有重金屬結(jié)合域(heavy metal associated domian)以及蛋白互作的基序(motif)。Pb1[20]的抗性供體為秈稻品種Modan，是目前唯一一個抗穗頸瘟的主效QTL，該基因的抗性強弱與表達水平高低有關(guān)，基因編碼CC－NBS－LRR蛋白，含有1 296個氨基酸。

4 分子標(biāo)記技術(shù)在稻瘟病抗性基因研究及水稻抗病育種中的應(yīng)用

與稻瘟病抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記對抗源的有效應(yīng)用極為重要，同時也是圖位克隆該基因的基礎(chǔ)和前提。第一代分子標(biāo)記是基于DNA雜交技術(shù)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記，如限制性片段長度多態(tài)性分子標(biāo)記(restriction fragment length polymorphism，RFLP)。RFLP是應(yīng)用最早的分子標(biāo)記技術(shù)，廣泛應(yīng)用于早期抗病基因定位工作中。20世紀80年代，McCouch等利用135個RFLP分子標(biāo)記構(gòu)建了一張覆蓋水稻12條染色體，共1 389 cM的遺傳圖譜[21]。但由于RFLP對DNA的需求量大，操作復(fù)雜，費用昂貴，分析速度慢，同位素檢測對人體有害等缺點，在大規(guī)模應(yīng)用中受到限制。在聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)發(fā)明以后(1987年，Mullis和Faloona)，因其操作比較簡單，成功率較高，后期涌現(xiàn)了一大批以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)[22]，如簡單序列重復(fù)分子標(biāo)記(simple sequence repeat，SSR)。由于SSR具有重復(fù)性高，品種間多態(tài)性豐富，可靠性高，快速簡便，對DNA質(zhì)量要求不高等諸多優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用到基因定位等相關(guān)領(lǐng)域。隨著測序技術(shù)的迅猛發(fā)展，越來越多的物種的基因組測序完成，分子標(biāo)記技術(shù)也得到了不斷的提高和完善。如今，不僅核基因組的衛(wèi)星DNA被廣泛用于分子標(biāo)記來檢測遺傳多樣性，一些其他細胞器的衛(wèi)星DNA也用來作為分子標(biāo)記，例如，葉綠體衛(wèi)星 DNA[23]，線粒體衛(wèi)星 DNA[24]等。

Pi40[25]是一個抗譜很廣的稻瘟病抗性基因，來源于水稻品種IR65482－4－136－2－2，被定位于標(biāo)記S2539和RM3330之間的70 kb的區(qū)域[26]。該基因?qū)碜杂陧n國、菲律賓的多個稻瘟病菌小種都表現(xiàn)抗性。Pi35能解釋69.4%表型變異的QTL，被Ngugen等成功定位于1號染色體SSR標(biāo)記RM1216和RM1003之間的3.5 cM 內(nèi)。Liu[27]等綜合應(yīng)用SSR和RFLP兩種分子標(biāo)記技術(shù)從三黃占2號中定位了控制病斑葉面積60.3%的變異的5個抗瘟性QTLs。Miyamoto[28]等對抗稻瘟病基因 Pi－ b 進行了精細地位，該基因位于12號染色體長臂，標(biāo)記RZ123和RAPD標(biāo)記b－1共分離。Pid3是未經(jīng)定位直接利用Nipponbare中的假基因設(shè)計分子標(biāo)記，通過得到與感病表型共分離的分子標(biāo)記，而獲得的一個抗瘟基因[29]。

傳統(tǒng)的水稻抗性育種主要通過鑒定抗性和選擇表型來實現(xiàn)，包括人為創(chuàng)造的增壓選擇，這些都要求育種家具備豐富的實踐經(jīng)驗，并且所花費的時間較長，效率相對低，外界環(huán)境對其影響較大。隨著分子標(biāo)記輔助育種(MAS)的發(fā)展，通過利用與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記對目標(biāo)性狀進行間接選擇，加快了分析速度且操作簡便。研究表明，當(dāng)分子標(biāo)記距離目的基因的遺傳距離小于5 cM時，能選擇到含有目的基因的植株的正確率在99.75%以上[30]。

5 問題與展望

(1)已有稻瘟病抗性基因研究大都集中在幾個大的基因簇上，如Pi9和Pik基因家族，這些基因家族在不同的水稻品種中含類似等位的抗性基因，但是存在抗譜差異。通過對表現(xiàn)高抗的水稻品種的抗性基因進行同源克隆和功能鑒定，可在育種過程中發(fā)現(xiàn)新的抗性基因。稻瘟病抗性材料與感病材料中的等位基因可能只是一個或幾個氨基酸的不同，且稻瘟病抗性材料中的抗性基因往往含有多個候選基因，如Pi9和Pi50。除了功能基因外，其余都是假基因，它們之間有著復(fù)雜的進化關(guān)系，一般認為這是進化過程中的抗性基因通過重組、缺失、點突變或串聯(lián)重復(fù)形成的，闡明這些進化關(guān)系，可能提供新的發(fā)掘稻瘟病抗性基因的途徑。

(2)轉(zhuǎn)基因技術(shù)被稱為第二次“綠色革命”[31]，這場技術(shù)革命將可能使全球農(nóng)業(yè)發(fā)生深刻的變革。同樣，轉(zhuǎn)基因技術(shù)也將用于植物抗病研究中，如多基因聚合等。2008年起，國家及各地已陸續(xù)啟動了水稻轉(zhuǎn)基因抗病分子育種重大專項，這樣更加快了水稻抗稻瘟病基因的研究與應(yīng)用的步伐。但是，目前的植物抗病基因研究存在一些問題，如轉(zhuǎn)基因多拷貝誘發(fā)的基因沉默和轉(zhuǎn)基因體系多代后外源基因丟失，轉(zhuǎn)基因植物環(huán)境釋放的生態(tài)風(fēng)險評估等問題引起了廣泛的爭議。

(3)通過常規(guī)育種或分子育種等手段將多個基因轉(zhuǎn)育到同一品種中，這種方法稱為基因聚合。在稻瘟病抗性育種中，也廣泛采用了這種方法。劉士平等研究表明，基因聚合后抗譜增寬，抗性增強，說明基因聚合是培育稻瘟病持久抗性品種的有效方法[32]。

因為水稻稻瘟病菌生理小種的高度復(fù)雜和頻繁變異，注定了稻瘟病的長期存在。為了減少稻瘟病帶來的產(chǎn)量和經(jīng)濟損失，必須發(fā)掘和鑒定更多的抗稻瘟病基因，并研究在育種和栽培過程中怎樣合理利用它們，如及時了解當(dāng)?shù)氐疚敛∩砭旱膭討B(tài)變化，科學(xué)更替水稻抗病新品種，最大限度地延長水稻品種抗性;準(zhǔn)確預(yù)測稻瘟病生理菌群結(jié)構(gòu)的變化，篩選合適的主效抗瘟基因，并搭配多個微效基因，選育出攜帶多個基因的聚合系水稻品種，進而提高抗性。

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