魏淑榮，陳新山，陳煌峰，3，孫許朋，4，黃光照

（1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，湖北 武漢 430030；2.益陽市公安局刑偵支隊(duì)，湖南 益陽 413000；3.武漢市公安局刑事偵查局，湖北 武漢 430019；4.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)教研室，河南 新鄉(xiāng) 453003）

擴(kuò)張型心肌病心肌Fas蛋白表達(dá)

魏淑榮1，2，陳新山1，陳煌峰1，3，孫許朋1，4，黃光照1

（1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，湖北 武漢 430030；2.益陽市公安局刑偵支隊(duì)，湖南 益陽 413000；3.武漢市公安局刑事偵查局，湖北 武漢 430019；4.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)教研室，河南 新鄉(xiāng) 453003）

目的 探討擴(kuò)張型心肌?。╠ilated cardiomyopathy，DCM）心肌Fas蛋白的表達(dá)情況及其與DCM猝死的關(guān)系。 方法 用免疫組織化學(xué)法和圖像分析技術(shù)定量檢測本教研室1997—2007年間9例DCM猝死和11例暴力死或其他死者的心肌Fas蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果 DCM猝死組心肌Fas蛋白表達(dá)明顯增多，陽性著色在心肌縱切面細(xì)胞膜上及胞漿內(nèi)呈棕黃色顆粒狀或條狀分布，橫斷面細(xì)胞膜見環(huán)形棕黃色顆粒帶；對照組未見明顯變化或僅見小面積淺淡著色。定量檢測結(jié)果顯示其表達(dá)面積在兩組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002），表達(dá)的平均光密度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.675）。 結(jié)論 DCM猝死者心肌Fas蛋白表達(dá)明顯增多，可能與DCM患者發(fā)生的因心律失常和心功能衰竭所致猝死有關(guān)。

法醫(yī)病理學(xué)；心肌病，擴(kuò)張型；免疫組織化學(xué)；Fas蛋白

擴(kuò)張型心肌?。╠ilated cardiomyopathy，DCM）是心血管系統(tǒng)疾病中對人類生命健康危害性較大的疾病之一。其確切的病因、發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚。近年來，不少學(xué)者從蛋白水平、基因遺傳和基因突變等方面探討其發(fā)病原因及發(fā)病機(jī)制，以尋求新的診斷、治療和預(yù)防方法[1-2]。有研究[3-4]表明，許多心血管疾病與心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)，而凋亡蛋白Fas表達(dá)的改變與DCM的發(fā)生有密切聯(lián)系。為此，本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)SABC法和圖像分析技術(shù)對9例DCM猝死者及11例對照組的心肌Fas蛋白表達(dá)情況進(jìn)行研究，以期為進(jìn)一步探討DCM的病因、發(fā)病機(jī)制和猝死機(jī)制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 病例及分組

從華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系1997—2007年共11年間的法醫(yī)病理學(xué)尸檢檔案中挑選DCM猝死的心臟標(biāo)本共9例，為DCM猝死組。其中，男性8例、女性1例；年齡為9歲的未成年人1例，8例成年人年齡22～46歲（平均35.1歲）。從死亡到尸檢時(shí)間為7～24h。另選同期且年齡相近的暴力死和非心肌病死者11例為對照組。其中男性9例、女性2例；未成年人3例，年齡分別為11、15、17歲，8例成年人年齡20～39歲（平均28.1歲）。從死亡到尸檢時(shí)間為8～25h。死因?yàn)橹卸?例、電擊死2例、機(jī)械性窒息和顱腦外傷各1例，其他疾病猝死3例。

DCM猝死組的病例選擇標(biāo)準(zhǔn)：（1）按1996年世界衛(wèi)生組織/國際心臟病學(xué)會（WHO/ISFC）公布的關(guān)于心肌病的診斷標(biāo)準(zhǔn)分類；（2）有不同程度的DCM病變；（3）從發(fā)病至死亡的時(shí)間lt;24 h；（4）經(jīng)過全面系統(tǒng)尸解和病理切片檢查，部分病例還進(jìn)行毒物化驗(yàn)，排除機(jī)械性損傷、機(jī)械性窒息、中毒及其他自然疾病猝死。

1.2 心臟檢查、取材及制片

每例心臟進(jìn)行常規(guī)病理學(xué)檢查，包括心臟的質(zhì)量、大小、形狀、左右心室和室間隔厚度等。在左心室前壁和右心室共取材3份，一份做常規(guī)石蠟切片、HE染色，一份做免疫組織化學(xué)染色，另一份備用。

1.3 主要儀器

石蠟切片機(jī)（美國AO公司），光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司），普通冰箱，PYX-DHS-35X40隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱，HMIAS-2000型全自動彩色圖文報(bào)告分析系統(tǒng)（本院病理學(xué)教研室提供）。

1.4 主要試劑及其配制

一抗：兔抗人Fas多克隆抗體（武漢博士德生物工程有限公司）。試劑盒：免疫組織化學(xué)SABC試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。顯色劑：3，3-二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色劑試劑盒，內(nèi)含DAB（A液）、H2O2（B液）和Tris（C液）的濃縮液各3mL；供免疫組織化學(xué)染色的載玻片預(yù)先經(jīng)多聚賴氨酸處理，由武漢博士德生物工程有限公司提供。

試劑配制：（1）0.1mol/L pH=7.4的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）：0.2 mol/L Na2HPO4溶液（Na2HPO4·12H2O 7.164 g，加蒸餾水至1 000 mL）81 mL和 0.2 mol/L NaH2PO4溶液（NaH2PO4·2H2O 3.121 g，加蒸餾水至1 000 mL）19 mL，加蒸餾水至2000mL，室溫保存?zhèn)溆谩＃?）0.3%H2O2甲醇溶液：將甲醇100 mL與1 mL的30%H2O2充分混勻，放置備用。（3）粘片劑的配制：現(xiàn)用現(xiàn)配，重鉻酸鉀溶液處理過的干凈載玻片放入以1∶50丙酮稀釋的APES中，停留20～30s，取出后略干燥片刻，再入純丙酮溶液涮去未結(jié)合的APES，置通風(fēng)櫥中晾干，保存?zhèn)溆谩＃?）顯色劑的配制：使用前將試劑盒中提供的A、B、C 3種試劑各1滴加至1mL雙蒸水中，即可獲得1mL DAB工作液。

1.5 免疫組織化學(xué)染色方法及步驟

免疫組織化學(xué)染色采用鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶法（strept avidin biotin complex，SABC）。具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。染色過程中用PBS緩沖液取代一抗作為空白對照。結(jié)果判斷：棕黃色顆粒為Fas表達(dá)陽性，Mayer’s蘇木素復(fù)染細(xì)胞核為淡藍(lán)色。

1.6 圖像分析及統(tǒng)計(jì)處理

用HMIAS-2000型全自動彩色圖像分析系統(tǒng)，對Fas免疫組織化學(xué)染色切片進(jìn)行定性和定量檢測Fas蛋白表達(dá)情況。每張切片鏡下放大200倍，隨機(jī)取3～5個(gè)視野，測量各組Fas蛋白陽性反應(yīng)面積和平均光密度。圖像攝入：在200倍光鏡下分別隨機(jī)取3～5個(gè)視野，將圖像存入計(jì)算機(jī)。圖像測量：每張圖像測量Fas蛋白表達(dá)的面積和平均光密度。將所測數(shù)據(jù)用±s表示，用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，統(tǒng)計(jì)方法為t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié) 果

2.1 一般病理學(xué)變化

DCM猝死組的9例主要表現(xiàn)為心臟增大、心尖部變鈍圓，左、右心室腔擴(kuò)張，尤以左側(cè)為重（有3例4個(gè)腔室均擴(kuò)張）。1例9歲的未成年人心臟質(zhì)量123g，8例成年人為330～570g（平均469.5g）。左心室壁厚度為0.8～1.6 cm（平均1.21 cm），室間隔厚度為0.8～1.4cm（平均1.14cm）。鏡下見部分心肌細(xì)胞肥大，核大濃染、形狀各異；多數(shù)病例的心肌間質(zhì)纖維結(jié)締組織增多，3例有明顯的間質(zhì)性心肌纖維化，1例心肌間質(zhì)有淋巴細(xì)胞浸潤，伴有脂肪組織浸潤3例、心內(nèi)膜纖維組織增生3例。

11例對照組中，3例未成年人心臟質(zhì)量分別為125、182和243g，8例成年人心臟質(zhì)量230～330g（平均290 g），左心室壁厚度1.0～1.4 cm（平均1.19 cm），室間隔厚度為0.7～1.2 cm（平均1.02 cm），除間質(zhì)性心肌炎的心臟有相應(yīng)的病變外，未見心臟其他明顯病變。

2.2 心肌Fas蛋白免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

DCM猝死組經(jīng)免疫組織化學(xué)染色的心肌Fas蛋白表達(dá)明顯增多，陽性著色，在心肌縱切面細(xì)胞膜上及胞漿內(nèi)呈棕黃色顆粒狀或條狀分布，在橫斷面細(xì)胞膜見環(huán)形棕黃色顆粒條帶，部分弱陽性著色心肌的棕黃色顆粒較少、著色略淺（圖1）。對照組未見明顯變化或僅在著色深淺程度和表達(dá)面積上有輕度變化（圖2）。

圖1 DCM猝死組左心室心肌Fas蛋白表達(dá)增多，胞漿內(nèi)可見較多棕黃色顆粒 SABC×400

圖2 對照組左心室心肌內(nèi)未見Fas蛋白表達(dá)SABC×400

2.3 圖像分析檢測結(jié)果

心肌Fas蛋白表達(dá)面積在DCM猝死組與對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）；心肌Fas蛋白表達(dá)的平均光密度在兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表1）。

表1 兩組心肌Fas蛋白表達(dá)的面積和平均光密度的定量檢測結(jié)果 （±s）

表1 兩組心肌Fas蛋白表達(dá)的面積和平均光密度的定量檢測結(jié)果 （±s）

注：1）與對照組相比，P＜0.05

組別 平均光密度DCM猝死 0.0289±0.0691對照 0.0898±0.0209 n91 1面積0.2589±0.07681）0.0792±0.0391

3 討 論

3.1 Fas蛋白的生物學(xué)特性

1989年，日、美兩個(gè)科研小組先后從小鼠中分離出對多種人體細(xì)胞有溶解作用的抗體，并把這種抗體識別的細(xì)胞表面蛋白分別稱為Apo-1和Fas，后來經(jīng)分子克隆出的cDNA證明Apo-1和Fas實(shí)際上為一種成分。1993年的第五屆人類白細(xì)胞分化抗原分類國際會議將這種成分命名為CD95，它的相對分子質(zhì)量為45000。Fas基因定位于人類10號染色體q24.1區(qū)和小鼠的第19號染色體，由其編碼產(chǎn)生的Fas蛋白包含325個(gè)氨基酸，其N端有一個(gè)信號序列，穿膜區(qū)位于該蛋白分子中部，其胞漿區(qū)有一段長度為60～70個(gè)氨基酸序列，此序列含有3個(gè)周期性排列的完全半胱氨酸殘基亞區(qū)，又被稱為功能區(qū)或死亡區(qū)[5]。

Fas蛋白是一種細(xì)胞表面抗原，主要以膜受體形式存在，它還可以通過轉(zhuǎn)錄水平不同拼接或脫落產(chǎn)生可溶性的Fas分子。Fas蛋白與其配體（FasL）以及它們的可溶性形式共同構(gòu)成了介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的Fas系統(tǒng)。Fas屬于腫瘤壞死因子與神經(jīng)生長因子超家族成員，是位于細(xì)胞膜上的Ⅰ型跨膜受體[5]。FasL屬于腫瘤壞死因子與神經(jīng)生長因子受體超家族成員，F(xiàn)asL為Fas的配體[6]。以往研究表明，兩者結(jié)合將啟動細(xì)胞內(nèi)死亡信號，導(dǎo)致Fas陽性細(xì)胞凋亡[5]。Fas/FasL系統(tǒng)是體內(nèi)直接啟動細(xì)胞凋亡的信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，它是機(jī)體維持穩(wěn)定的一條重要途徑，該系統(tǒng)的異常表達(dá)常與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[7]。

3.2 Fas蛋白與擴(kuò)張型心肌病

DCM是一種原因不明的以心腔（左心室或右心室）擴(kuò)大、心肌收縮功能減弱為主要特征的心肌疾病。臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性加重的心力衰竭、心律失常甚至猝死。以往認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制主要與病毒感染后的自身免疫反應(yīng)有關(guān)。80年代以后，遺傳因素與DCM的關(guān)系逐漸受到重視，有人提出將DCM出現(xiàn)家族聚集的現(xiàn)象稱為家族性擴(kuò)張型心肌病（familial dilated cardiomyopathy，F(xiàn)DCM）[8]。近年來，在對心臟病的病因研究中，相繼報(bào)道了細(xì)胞凋亡參與心臟疾病的可能性[9]。正常成熟個(gè)體的心肌細(xì)胞凋亡非常少見，只有當(dāng)某種致病因素出現(xiàn)后，才可導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡的大量發(fā)生，過度的心肌細(xì)胞凋亡將導(dǎo)致心力衰竭[10]。

有報(bào)道[11]表明DCM的發(fā)生和發(fā)展中也有細(xì)胞凋亡機(jī)制參與。另有研究[4]報(bào)道凋亡是DCM的心肌細(xì)胞丟失和心功能不全的重要機(jī)制，并且DCM是通過Fas/FasL系統(tǒng)介導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡；同時(shí)DCM患者存在免疫調(diào)節(jié)異常，這可能與心肌細(xì)胞凋亡有一定關(guān)系。因此，心肌Fas表達(dá)的改變與DCM的發(fā)病及猝死有密切的關(guān)系。

本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)和圖像分析技術(shù)，對DCM猝死者及其他死因的對照組心肌Fas蛋白表達(dá)情況進(jìn)行定性定量檢測，發(fā)現(xiàn)DCM猝死病例經(jīng)免疫組織化學(xué)染色的心肌Fas蛋白表達(dá)明顯增多，陽性著色在心肌縱切面細(xì)胞膜上及胞漿內(nèi)呈棕黃色顆粒狀或條狀分布，橫斷面細(xì)胞膜見環(huán)形棕黃色顆粒帶，而對照組未見明顯變化，或僅在著色深淺程度上有輕度的變化，說明DCM猝死者心肌Fas蛋白表達(dá)明顯增高，與對照組之間的差異明顯，而心肌Fas蛋白表達(dá)的這種數(shù)量改變可能與DCM發(fā)生的因心律失常和心功能衰竭所致猝死有關(guān)。

雖然本研究用免疫組織化學(xué)SABC法對心肌Fas蛋白表達(dá)進(jìn)行了初步研究，但由于心肌細(xì)胞凋亡可能是多因素共同作用的結(jié)果，故DCM猝死者心肌凋亡的機(jī)制仍不清楚。且本組資料的樣本例數(shù)不多，故需進(jìn)一步收集更多病例，進(jìn)行多個(gè)凋亡因素表達(dá)的比較等方面的研究，以及進(jìn)一步在分子水平上測量mRNA的變化或利用反義mRNA探針測定基因表達(dá)的變化，若能查清Fas蛋白的表達(dá)情況及其影響因素，并探討有效控制其異常表達(dá)的方法和途徑，可能更有助于DCM的診斷和治療，從而為防治DCM、降低猝死的發(fā)生率以及DCM猝死的法醫(yī)學(xué)鑒定提供更準(zhǔn)確的參考資料。

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2012-02-03）

（本文編輯：張建華）

Expression of Fas Protein of Myocardium in Dilated Cardiomyopathy

WEI Shu-rong1,2,CHEN Xin-shan1,CHEN Huang-feng1,3,SUN Xu-peng1,4,HUANG Guang-zhao1
（1.Department of Forensic Medicine,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China;2.Criminal Investigation Detachment,Yiyang Public Security Bureau,Yiyang 413000,China;3.Department of Criminal Investigation,Wuhan Public Security Bureau,Wuhan 430019, China;4.Department of Forensic Medicine,Xinxiang Medical College,Xinxiang 453003,China）

Objective To investigate Fas protein expression of the myocardium in dilated cardiomyopathy（DCM）and its relationship with occurrence of sudden death caused by DCM.Methods Nine autopsy cases of sudden death caused by DCM along with the heart samples were chosen from the archives in the Department of Forensic Medicine,Tongji Medical College,HUST from 1997 to 2007.Other 11 cases which died of violence and other diseases were selected as the control group.Expressions of myocardial Fas protein in the samples were quantitatively detected by immunohistochemistry and computerized imaging analysis.Results Myocardial Fas protein expression increased significantly in the DCM group.Positive color showed brown-yellow granulated or striped distribution in the longitudinal section of myocardial within the cell membrane and cytoplasm,and showed circular brown granules in the cross section of the cell membrane,while these changes were not observed in the control group though there was focal weak staining noted.Statistical significance was observed between the experimental and control groups（P=0.002）,but no statistical significance was found for the average optical density value between these two groups（P=0.675）. Conclusion The expression of Fas protein increased obviously in the DCM group.Such alteration in expression quantity and distribution of myocardial Fas protein may be related to arrhythmia and heart failure in the patients with DCM.

forensic pathology;cardiomyopathy,dilated;immunohistochemistry;Fas protein

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2012.04.003

1004-5619（2012）04-0252-04

武漢市科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（201060623254）

魏淑榮（1983—），女，湖北武漢人，碩士研究生，主要從事法醫(yī)病理和法醫(yī)物證的檢案和科研工作；E-mail：lianxi19831225@yahoo.com.cn

陳新山，男，博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事法醫(yī)病理學(xué)教學(xué)、科研和檢案工作；E-mail：xschen@mails.tjmu. edu.cn