張 強(qiáng)，邱洪斌(佳木斯大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院， 黑龍江 佳木斯 154007)

叢玉婷(大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連116023)

尹相林(佳木斯大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院， 黑龍江 佳木斯154007)

類黃酮化合物對DU145前列腺癌細(xì)胞的抑制作用

張 強(qiáng)，邱洪斌(佳木斯大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院， 黑龍江 佳木斯 154007)

叢玉婷(大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，遼寧 大連116023)

尹相林(佳木斯大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院， 黑龍江 佳木斯154007)

目的：觀察類黃酮化合物對前列腺癌DU145細(xì)胞的抑制作用。方法：采用光學(xué)顯微計數(shù)法，考察不同濃度染料木黃酮、木犀草素以及槲皮素對DU145細(xì)胞的增殖抑制活性；采用流式細(xì)胞儀，分析和比較上述3種化合物對DU145細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。結(jié)果：染料木黃酮、木犀草素以及槲皮素均能抑制DU145細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)該細(xì)胞發(fā)生S期停滯和細(xì)胞凋亡，三者的活性順序是：染料木黃酮gt;木犀草素gt;槲皮素。結(jié)論：類黃酮化合物對DU145細(xì)胞具有顯著的抑制活性。

類黃酮化合物；前列腺癌；細(xì)胞凋亡；抗癌活性

前列腺癌是一種浸潤性較強(qiáng)的惡性腫瘤，在導(dǎo)致男性死亡的腫瘤中僅次于肺癌[1]。西方國家的前列腺癌發(fā)病率明顯高于亞洲國家，形成這一差異的重要因素之一是東西方飲食習(xí)慣的不同[2]。在包括我國在內(nèi)的亞洲國家人群中，植物性食物的攝入量明顯高于西方國家，而植物性食物中的類黃酮化合物含量極為豐富[3]。因此，類黃酮化合物與前列腺癌之間的關(guān)系，已成為目前人們十分關(guān)注的問題。針對這一問題，我們以DU145細(xì)胞為前列腺癌體外研究模型，探索染料木黃酮、木犀草素和槲皮素等膳食中含量豐富的類黃酮化合物，對DU145的細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞周期循環(huán)的影響，進(jìn)而明確類黃酮化合物對前列腺癌的抑制作用。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器

染料木黃酮(純度gt;95%)購自Sigma公司；槲皮素、木犀草素(純度均gt;95%)購自南京青澤醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；碘化丙錠(PI)、二甲基亞砜(DMSO)以及RNase購自北京索萊寶生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI試劑盒購自北京寶賽生物技術(shù)有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

人前列腺癌DU145細(xì)胞(購自北京協(xié)和細(xì)胞中心)，于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100mg/L鏈霉素的RPMI1640(Gibco)培養(yǎng)液中常規(guī)(37℃，5%CO2)培養(yǎng)。

1.3細(xì)胞增殖抑制檢測

將細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h后，分別加入染料木黃酮、木犀草素、槲皮素的 DMSO (lt;0.1%)溶液。作用濃度為100、80、40、20μmol/L，作用時間均為24h。0.1%DMSO細(xì)胞處理組分別作為陰性對照。倒置顯微鏡下觀察計數(shù)，研究各化合物在不同濃度下對細(xì)胞的增殖抑制作用。

1.4細(xì)胞周期檢測

將細(xì)胞接種于6孔中，分別加入濃度為80μmol/L的類黃酮化合物作用24h后，胰酶消化收集細(xì)胞；PBS緩沖液清洗3次，800g離心6min，去上清；加1ml PBS緩沖液重懸細(xì)胞，再次離心棄上清；用300μl的PBS 重懸細(xì)胞，將細(xì)胞逐滴加入700μl 預(yù)冷的無水乙醇中，乙醇終濃度為70%，4℃避光固定過夜；800g 離心10min，去上清；加2mg/ml的PI 至終濃度50μg/ml，避光孵育30min，以PI 熒光讀數(shù)為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，在流式細(xì)胞儀上計數(shù)細(xì)胞周期各期的細(xì)胞數(shù)目。

1.5流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡率

接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h后，分別加入濃度為80μmol/L的類黃酮化合物作用24h。按照Annexin V-FITC/PI試劑盒廠家說明進(jìn)行細(xì)胞染色后，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1類黃酮化合物對DU145細(xì)胞的增殖抑制活性

圖1 類黃酮化合物對DU145細(xì)胞的增殖抑制作用

采用光學(xué)顯微計數(shù)法，考察不同濃度染料木黃酮、木犀草素以及槲皮素對DU145前列腺癌細(xì)胞的增殖抑制活性。結(jié)果如圖1所示，3個類黃酮化合物對DU145細(xì)胞均表現(xiàn)出增殖抑制作用，這種抑制作用呈劑量依賴關(guān)系。其中，染料木黃酮對DU145細(xì)胞增殖的抑制活性相對最強(qiáng)，其次是木犀草素，槲皮素相對活性較弱。

2.2類黃酮化合物對DU145細(xì)胞周期循環(huán)的影響

采用流式細(xì)胞儀，分析比較染料木黃酮、木犀草素以及槲皮素對DU145前列腺癌細(xì)胞周期循環(huán)的影響。結(jié)果如圖2所示，3個類黃酮化合物作用DU145細(xì)胞后，能夠誘導(dǎo)DU145細(xì)胞周期循環(huán)發(fā)生S期停滯。其中，染料木黃酮對DU145細(xì)胞S期停滯的誘導(dǎo)活性相對最強(qiáng)，其次是木犀草素，槲皮素活性相對較弱。

圖2 類黃酮化合物對DU145細(xì)胞周期循環(huán)的影響

2.3類黃酮化合物誘導(dǎo)DU145細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞儀分析

通過PI和FITC-Annexin V標(biāo)記DU145細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞儀檢測。結(jié)果如圖3所示，3個類黃酮化合物作用DU145細(xì)胞后，凋亡DU145細(xì)胞的比例顯著增加。其中，染料木黃酮對DU145細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)活性相對最強(qiáng)，其次是木犀草素，槲皮素活性相對較弱。

圖3 類黃酮化合物對DU145細(xì)胞凋亡的影響

3 討 論

我們通過光學(xué)顯微計數(shù)發(fā)現(xiàn)，3種類黃酮化合物(染料木黃酮、木犀草素、槲皮素)均能抑制DU145前列腺癌細(xì)胞增殖，且抑制效果與化合物的作用濃度呈明顯正相關(guān)。這一結(jié)果與前期相關(guān)研究具有一定的相似性[4-5]。在比較3種類黃酮化合物的抗癌細(xì)胞增殖活性時，可以發(fā)現(xiàn)染料木黃酮的抑制活性相對最強(qiáng)，其次是木犀草素，槲皮素相對活性較弱。由此表明，異黃酮結(jié)構(gòu)相對黃酮結(jié)構(gòu)，對前列腺癌細(xì)胞具有更強(qiáng)的抑制活性。

癌細(xì)胞的增殖速度取決于癌細(xì)胞分裂的速度，而細(xì)胞周期循環(huán)的狀態(tài)直接反映了癌細(xì)胞分裂速度的變化。我們通過流式細(xì)胞儀研究發(fā)現(xiàn)，染料木黃酮、木犀草素、槲皮素能夠誘導(dǎo)DU145細(xì)胞周期循環(huán)停滯于S期。以往研究認(rèn)為，類黃酮化合物誘導(dǎo)的細(xì)胞周期停滯發(fā)生于G0/G1期和G2/M期[6-7]。此次發(fā)現(xiàn)類黃酮化合物引發(fā)的S期細(xì)胞周期停滯，對于完善類黃酮化合物抗癌機(jī)制理論具有重要價值。另外，我們通過流式細(xì)胞儀分析了DU145細(xì)胞經(jīng)化合物作用后的細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示3種類黃酮化合物均能夠誘導(dǎo)DU145發(fā)生細(xì)胞凋亡。這一結(jié)果與以往研究發(fā)現(xiàn)具有高度的相似性[8-9]。

綜上所述，通過分析3種結(jié)構(gòu)不同的類黃酮化合物，對前列腺癌細(xì)胞DU145細(xì)胞的抑制作用，不僅明確了類黃酮化合物抗前列腺癌的優(yōu)勢分子結(jié)構(gòu)，而且發(fā)現(xiàn)了類黃酮化合物能夠誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞發(fā)生S期細(xì)胞周期停滯，從而拓寬了對類黃酮化合物抗癌機(jī)制的了解。

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[編輯] 一 凡

R737.25；O629

A

1673-1409(2012)05-R001-03

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2012.05.001

2012-04-15

黑龍江省教育廳面上項目(12511567)

張強(qiáng)(1979-)，男，山東濟(jì)南人，助理研究員，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)研究。