闞春燕， 高 鵬， 袁 冬， 杜丹華， 吳 江

缺血性腦卒中(ischemic stroke，IS)是致殘率和致死率最高的常見疾病之一［1］。而動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)斑塊破裂和血栓形成是導致急性心腦血管事件的主要原因。

近年來，研究者認識到動脈粥樣硬化是由多種炎性細胞因子參與的血管慢性炎癥反應過程，炎癥反應和AS的發(fā)生發(fā)展密切相關［2］。由iNOS催化產(chǎn)生的NO是機體慢性炎癥反應的重要參與因子之一［3］，可引起血管內(nèi)皮損傷、促進血管壁的炎癥反應，還可氧化LDL形成ox-LDL，促進動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，導致粥樣斑塊的不穩(wěn)定［4］。因此，我們對編碼iNOS的NOS2A基因多態(tài)性進行檢測，探討其與缺血性腦卒中的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取吉林大學第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科2009年～2010年的住院患者324例作為病例組，其中男234 例，女90 例，平均年齡(57.1 ±10.1)歲，經(jīng)神經(jīng)科檢查、頭部CT或頭部MRI明確腦卒中診斷，并除外房顫、腫瘤等栓子來源的腦栓塞性疾病，除外肝腎功能不全及血液系統(tǒng)疾病。由患者本人或其家屬提供患者的臨床癥狀及既往病史。對照組來自吉林大學第一醫(yī)院體檢中心的健康體檢者，共455例，其中男319例，女136例，平均年齡(50.7±8.8)歲。入組對象簽署知情同意書，并采集全血用于DNA提取。

1.2 選擇 NOS2A啟動子區(qū)-969G/C，-1173C/T的兩個位點為遺傳標記，通過對NOS2A啟動子區(qū)進行全長測序以分析這兩個位點的基因型。

1.3 實驗方法 (1)標本采集:抽取患者、對照者空腹外周靜脈血置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?2)基因組DNA的提取:采用Wizard基因組DNA提取試劑盒(美國Promega公司)抽提基因組DNA。(3)基因組DNA濃度與純度測定:用ND-1000紫外/可見光分光光度計(NanoDrop，美國)進行定量測定，調整模板DNA濃度在25～50ng/μl。(4)聚合酶鏈反應(PCR):基因引物由上海生工生物工程技術有限公司合成，其核苷酸序列如下:上游引物:5’-AAAACCCTCTCAAAACAGC-3’;下游引物:5’-TTGGTAGAGACTGGGTTTCA-3’。 反 應 體 系(20μl):DNA 模板 2μl、10 × buffer 2μl、dNTP 1μl、PCR 引物2μl(上游引物、下游引物各 1μl、TaqDNA聚合酶 0.15μl、ddH2O 12.85μl)。PCR 反應條件:預變性 95℃5min，變性 94℃30s，退火 66℃40s，延伸72℃1min30s，共進行 38個循環(huán)，最后延伸 72℃10min。(5)PCR產(chǎn)物的檢測:取PCR擴增產(chǎn)物2μl進行2%瓊脂糖凝膠電泳，JS-380A凝膠成像系統(tǒng)(上海培清科技有限公司)下觀察結果。(6)PCR產(chǎn)物回收純化:PCR產(chǎn)物轉移到AcroPrep 384濾板上進行濃縮純化。(7)PCR產(chǎn)物測序:將已純化的基因組DNA樣本經(jīng)熱循環(huán)處理后于ABI 3730 DNA Analyzer(ABI，美國)進行掃描測序。

1.4 統(tǒng)計學分析 應用擬和優(yōu)度檢驗分析病例組和對照組基因型頻率的分布是否符合Hardy-Weinberg(H.W)平衡;UNPHASED遺傳學軟件應用cocaphase對等位基因頻率進行分析，SPSS 15.0軟件應用卡方檢驗對基因型頻率進行分析。

2 結果

2.1 -969G/C、-1173C/T不是中國北方漢族人的SNP位點 通過對NOS2A基因啟動子區(qū)的測序，發(fā)現(xiàn)-969G/C、-1173C/T不是中國北方漢族人的SNP位點，NOS2A-969C位點的等位基因均為 T，NOS2A-1173C位點的等位基因均為G。

2.2 腦卒中組與對照組rs2779248位點Hardy-Weinberg平衡檢驗 我們在NOS2A基因啟動子區(qū)檢測到了rs2779248位點，并對該位點在腦卒中組與對照組的等位基因及基因型頻率進行了比較。擬和優(yōu)度檢驗表明病例組(χ2=0.015，P=0.903)和對照組(χ2=3.141，P=0.076)rs2779248 的基因型分布均未偏離H-W平衡。

2.3 腦卒中組與對照組rs2779248位點等位基因頻率比較 腦卒中組與對照組rs2779248位點等位基因頻率比較無明顯差異(P=0.889，χ2=0.019，見表1)。

2.4 腦卒中組與對照組rs2779248位點基因型頻率比較 腦卒中組與對照組rs2779248位點基因型頻率比較無明顯差異(P=0.889，χ2=0.019，見表2)。

表1 腦卒中組與對照組rs2779248位點等位基因頻率比較

表2 腦卒中組與對照組rs2779248位點基因型頻率比較

3 討論

一氧化氮(nitric oxide，NO)是生物體內(nèi)一種重要的信號分子，它是由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)催化 L-精氨酸(L-arginin)轉化而成［5］，而NOS又分為誘導型一氧化氮合酶、內(nèi)皮型一氧化氮合酶以及神經(jīng)元型一氧化氮合酶3個亞型［6］。在動脈粥樣硬化血管平滑肌細胞中iNOS表達及活性增加，可誘導產(chǎn)生大量的NO自由基，引起過氧化亞硝酸鹽形成增多、活性增加，導致脂質過氧化和血管損傷，進而引起血管內(nèi)皮功能障礙、炎性介質釋放，加重血管炎癥反應，從而促進動脈粥樣硬化的發(fā)展。而動脈粥樣硬化又是腦卒中發(fā)病的重要病理生理基礎，因此我們將編碼iNOS的NOS2A基因作為候選基因。

NOS2A 基因定位于17q11.2-q12，全長37kb，包含26個外顯子和25個內(nèi)含子。已有研究表明iNOS基因多態(tài)性與潰瘍性結腸炎、克羅恩病、風濕性關節(jié)炎、前列腺癌、胃癌等多種炎癥及免疫調節(jié)反應相關疾病有關［7］。針對NOS2A基因進行的基因治療可明顯減小心肌梗死的體積［8］。杜丹華等對NOS2A基因多態(tài)性與腦卒中合并冠心病的關系進行了檢測，發(fā)現(xiàn)rs28944190位點C等位基因與腦卒中合并冠心病的發(fā)生存在相關性［9］。Hobbs等在坦桑尼亞和肯尼亞進行的研究證實NOS2A基因啟動子區(qū)-969G/C、-1173C/T變異可減輕瘧疾感染后癥狀的嚴重程度［10，11］。NOS2A 啟動子區(qū)變異與原發(fā)性高血壓有關［5］。此外NOS2A基因是炎癥反應通路中的一個關鍵基因。因此我們選擇NOS2A基因為候選基因，以-969G/C、-1173C/T位點為候選位點，采用啟動子區(qū)全長測序的方法探討NOS2A基因啟動子區(qū)基因多態(tài)性與缺血性腦卒中的關系。我們發(fā)現(xiàn)NOS2A-969G/C、-1173C/T位點在中國北方漢族人中不存在變異，說明SNPs在不同種族間存在差異。我們在NOS2A啟動子區(qū)檢測到了rs2779248位點，關聯(lián)分析表明rs2779248位點與缺血性腦卒中無相關性。提示NOS2A基因啟動子區(qū)與缺血性腦卒中的發(fā)病無明顯相關。

雖然本研究未發(fā)現(xiàn)NOS2A基因啟動子區(qū)的常見變異與缺血性腦卒中的相關性，但在中國北方漢族人群NOS2A基因與高血壓、缺血性腦卒中嚴重程度等的關系還需要進一步的探討。

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