那存烏力吉，丁炎，張銀雪，王明明，陳磊

（中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，沈陽 1 1 0 0 0 1）

痛性糖尿病神經(jīng)病變（painful diabetic neuropathy，PDN）是糖尿病患者慢性疼痛綜合征常見原因之一［1］，其中3%~20%的糖尿病患者并發(fā)PDN后導(dǎo)致痛覺過敏和異常疼痛。其分子機制目前還不甚清楚。背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）是機體內(nèi)外環(huán)境與脊髓連接的紐帶，是初級感覺傳入的第一級神經(jīng)元，DRG神經(jīng)元中存在許多與疼痛相關(guān)的受體、離子通道以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。瞬時感受器電位離子通道香草素受體4（transient receptor potential vanilloid 4，TRPV4）是 DRG 上的一種多覺感受器［2］，可感受低滲膨脹、機械刺激、溫度（>27℃）、佛波醇酯衍生物、花生四烯酸的代謝產(chǎn)物等理化刺激；也是一種非選擇性陽離子通道［3］，參與炎性痛、機械性疼痛等傷害性感覺的發(fā)生發(fā)展。持續(xù)機械壓迫明顯增加TRPV4基因和蛋白的表達［4］。TRPV4在神經(jīng)痛、囊性纖維化、癌癥等不同病理生理條件發(fā)生發(fā)展中越來越受到重視［5］。在一些敏感性神經(jīng)元中，蛋白激酶 Cε（protein kinase C ε，PKCε）也參與多種類型疼痛有關(guān)傷害性感受器的調(diào)節(jié)。PKCε的激活能夠誘導(dǎo)機械痛覺過敏，它是一個已修飾的疼痛前信號分子［6］。此外，在細胞試驗中已證實，TRPV4與微管蛋白﹑肌動蛋白﹑神經(jīng)纖維蛋白﹑PKCε以及鈣離子依賴性蛋白激酶2在DRG神經(jīng)元中相互影響［7］。

本實驗擬通過觀察TRPV4和PKCεmRNA在高糖環(huán)境下培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元內(nèi)的表達，明確高糖環(huán)境對TRPV4和PKCε的影響，進一步探討PDN的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

出生1~3 d的SPF級SD大鼠24只（由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供），雌雄不拘，每只體質(zhì)量5~6 g。DRG細胞用DMEM/F12培養(yǎng)基（糖濃度為17.5 mmol/L）培養(yǎng)48 h后更換培養(yǎng)液并分組。根據(jù)培養(yǎng)液中糖濃度的不同，細胞分為3組：正常對照組（糖濃度為5.5 mmol/L，C組）、高糖1組（糖濃度為17.5 mmol/L，H1組）、高糖2組（糖濃度為35.0 mmol/L，H2組）。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM/F12（上海拜力生物科技有限公司）；RT-qPCR試劑盒、RNA提取試劑盒（日本TaKaRa公司）；L-多聚賴氨酸、DEPC-H2O、胰蛋白酶、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（鼎國昌盛生物公司）；PCR試劑盒（天根生化公司）；引物序列合成由TaKaRa公司完成。

1.3 DRG細胞的分離和培養(yǎng)

取新生SD大鼠，用75%乙醇常規(guī)消毒，麻醉并處死后在超凈臺內(nèi)分離椎管，剪開，暴漏脊髓并將其去除干凈，用顯微鑷摘除L4~L6段脊髓DRG，置于裝有4℃D-Hanks的玻璃皿中。取材完畢神經(jīng)節(jié)放入0.25%胰蛋白酶進行消化10 min，離心棄去胰酶，再將細胞接種至事先經(jīng)L-多聚賴氨酸處理的培養(yǎng)皿中，加入DMEM/F12培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后更換培養(yǎng)液。換液后48 h提取細胞總RNA。

1.4 RT-PCR和real-time PCR檢測TRPV4和PKCε mRNA的表達

提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板進行PCR擴增反應(yīng)，以β-actin為內(nèi)參照。定性PCR用引物序列：TRPV4上游：5′-AAGTGGCGTAAGTTCGGG-3′，下游：5′-TAAGGGTA GGGTGGCGTG-3′，擴增片段長度為122 bp。PKCε上游：5′-CGAGGACGACTTGTTTGAATCC-3′，下游：5′-CAGTTTCTCAGGGCATCAGGTC-3′，擴增片段長度為 389 bp。β-actin 上游：5′-AGACCTTCAACACC CCAG-3′，下游：5′-CACGATTTCCCTCTCAGC-3′，擴增片段長度為254 bp。擴增產(chǎn)物經(jīng)3%的瓊脂糖凝膠電泳并半定量分析。實時定量PCR用引物序列：TRPV4 上游：5′-ACCACGGTGGACTACCTGAG-3′，下游：5′-AGCCATCGACGAAGAGAGAA-3′，擴增片段長度為 133 bp。PKCε上游：5′-CCCCTTGTGACCA GGAACTA-3′，下游：5′-AGCTGGCCATCAGTAGACG A-3′，擴增片段長度為 109 bp。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)均用x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DRG神經(jīng)元分離及原代培養(yǎng)

神經(jīng)元突起生長明顯，多數(shù)比胞體直徑大，細胞之間形成網(wǎng)絡(luò)，胞體多為圓形、橢圓形，胞體邊緣較亮，折光性強。高糖中神經(jīng)元的貼壁生長及數(shù)量未發(fā)生明顯變化（圖1）。

2.2 高糖環(huán)境下大鼠DRG神經(jīng)元中PKCε、TRPV4 mRNA的表達

結(jié)果顯示，PKCεmRNA的表達與C組比較，H2組表達有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），而H1組表達沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。TRPV4表達結(jié)果顯示，與C組比較，H1組表達有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），而H2組表達沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），見表1，圖2。

表1 各組大鼠D R G神經(jīng)元中P K C ε、T R P V 4mR N A的表達（n，x±s）T a b.1P K C εa n dT R P V 4mR N Ae x p r e s s i o n s i n D R Gn e u r o n s i n r a t s（n，x±s）

3 討論

糖尿病神經(jīng)病變與高血糖和胰島素相關(guān)信號的丟失有關(guān)，其中高血糖是主要的致病因素。二?；视停╠iacylgycerol，DAG）在細胞內(nèi)的重要生理功能是激活PKC，高糖引起的DAG由細胞質(zhì)向細胞膜轉(zhuǎn)移，提高PKC與Ca2+、磷脂的親和力，胞液內(nèi)Ca2+在生理濃度下PKC即可被激活［8］。PKCε是屬于新型PKC同功酶類，在慢性疼痛的研究中，持續(xù)長時間的傷害性刺激容易導(dǎo)致組織損傷及外周炎癥，炎癥可以直接激活PKCε亞基，后者可以與編碼N型鈣通道的C端結(jié)合，從而使通道的開放增加［9］。TRPV4通道蛋白對機械刺激和低滲刺激的痛敏反應(yīng)主要與細胞內(nèi)蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）和PKCε 2條信號傳導(dǎo)通路有關(guān)［10］。在特定的細胞信號通路引起的紫彬醇誘導(dǎo)的神經(jīng)痛研究中顯示，PAR2以及下游的磷酸酶C、PKCε和PKA的激活，會進一步引起TRPV1、TRPV4以及TRPA1的敏化［11］。因此我們選擇疼痛傳導(dǎo)密切相關(guān)的DRG神經(jīng)元在體外模擬糖尿病高糖環(huán)境，研究高糖對DRG細胞內(nèi)PKCεmRNA、TRPV4mRNA表達的影響。

本研究結(jié)果顯示，高糖培養(yǎng)48 h后的TRPV4、PKCεmRNA表達水平與正常組比較明顯上調(diào)，然而TRPV4mRNA的表達水平?jīng)]有因糖濃度的升高而表達增強，而是在隨著糖濃度的升高先被誘導(dǎo)后被抑制，表現(xiàn)為H1組的表達高于H2組；與正常組比較，H1組表達上調(diào)。TRPV4是DRG上的一種多覺感受器［2］，參與機械性疼痛［4］、神經(jīng)痛［12］的痛覺傳導(dǎo)。高滲透壓（葡萄糖濃度40%）時可以有效阻滯蟾蜍坐骨神經(jīng)干神經(jīng)興奮的傳導(dǎo)［13］。因此，我們認為H1組中TRPV4mRNA的表達上調(diào)可能是PKCε以及滲透壓共同作用的結(jié)果，而在H2組中TRPV4 mRNA表達抑制可能是高滲透壓的主導(dǎo)作用。

綜上所述，高糖環(huán)境可以上調(diào)DRG神經(jīng)元中TRPV4和PKCεmRNA的表達，但是其上調(diào)時糖濃度水平不一致，說明TRPV4的激活除了受PKCε的調(diào)控外還受其它因素調(diào)節(jié)。

［1］Boulton AJ，Malic RA，Arezzo JC，et al.Diabetic somatic neuropathies［J］.Diabetes care，2004，27（6）：1458-1468.

［2］O’Neil RG，Heller S.The mechanosensitive nature of TRPV channels［J］.Pfluqers Arch，2005，451（1）：193-203.

［3］Watanabe H，Vriens J，Janssens A，et al.Modulation of TRPV4 gating by intra-and extracellular Ca2+［J］.Cell Calcium，2003，33（5-6）：489-495.

［4］張楊，王永慧，丁欣利，等.TRPV4在介導(dǎo)大鼠背根神經(jīng)節(jié)持續(xù)受壓后機械和熱痛敏中的作用［J］.中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2010，25（12）：1123-1130.

［5］Kwan HY，Huang Y，Yao X，et al.TRP channels in endothelial function and dysfunction［J］.Biochim Biophys Acta，2007，1772（8）：907-914.

［6］Kuhn J，Dina OA，Goswami C，et al.GPR30 estrogen receptor agonists induce mechanical hyperalgesia in the rat［J］.Eur J Neurosci，2008，27（7）：1700-1709.

［7］Goswami C，Kuhn J，Heppenstall PA，et al.Importance of non-selective cation channel TRPV4 interaction with cytoskeleton and their reciprocalregulationsinculturedcells［J］.PloSOne，2010，5（7）：e11654.

［8］Craven PA，Davidson CM，DeRubertis FR.Increase in diacylgycerol mass in isolated glomeruli by glucose from de novo symthesis of glycerolipids［J］.Diabetes，1990，39（6）：667-674.

［9］Maeno-Hikichi Y，Chang S，Matsumura K，et al.A PKC epsilon-ENH-channel complex specifically modulates N-tpye Ca2+channels［J］.Nat Neurosci，2003，6（5）：468-475.

［10］Alessandri-Haber N，Dina OA，Yeh JJ，et al.Transient receptor potential vanilloid 4 is essential in chemotherapy-induced neuropathic pain in the rat［J］.J Neurosci，2004，24（18）：4444-4452.

［11］Chen Y，Yang C，Wang ZJ，et al.Proteinase-activated receptor 2 sensitizes transient receptor potential vanilloid 1，transient receptor potential vanilloid 4，and transient receptor potential ankyrin 1 in paclitaxel-indused neuropathic pain［J］.Neuroscience，2011，193（10）：440-451.

［12］Alessandri-Haber N，Joseph E，Dina OA，et al.TRPV4 mediates pain-related behavior induced by mild hypertonic stimuli in the presence of inflammatory mediator［J］.Pain，2005，118（1-2）：70-79.

［13］金葉華.實驗觀察不同濃度的高滲葡萄糖溶液對蟾蜍坐骨神經(jīng)干動作電位的影響［J］.當(dāng)代醫(yī)學(xué)雜志，2007，110（1）：48-49.