陳傳萍，何群，王邵成，潘忠誠(chéng)，王天驕，張玉魁，鐘連聲，趙雨杰

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)生物芯片中心，衛(wèi)生部細(xì)胞生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 1 1 0 0 0 1）

CD15是細(xì)胞表面糖蛋白或糖脂含有的外鏈巖藻糖化的乙酰乳糖胺糖鏈，作為細(xì)胞黏附分子成員，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［1~4］。CD15s是CD15的唾液酸化形式，通過結(jié)合含有選凝素的血小板、粒細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)癌灶細(xì)胞轉(zhuǎn)移［5］。ST3GaL糖基轉(zhuǎn)移酶在催化CD15s的生物合成中起重要作用［6］。腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）是具有廣泛生物學(xué)活性的細(xì)胞因子［7］，對(duì)腫瘤細(xì)胞有多向調(diào)節(jié)和直接細(xì)胞毒作用［8］。肝癌患者血清TNF-α水平隨病情進(jìn)展明顯上升，隨肝病的有效治療其水平逐漸下降。腫瘤微環(huán)境中低劑量的TNF-α可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［9，10］。提示TNF-α在肝癌的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中起重要作用。研究表明，TNF-α能誘導(dǎo)多種腫瘤中CD分子含量的變化，從而影響細(xì)胞生物學(xué)功能［11］。本研究擬探討TNF-α對(duì)肝癌細(xì)胞系CD15、CD15s、ST3GaL糖基轉(zhuǎn)移酶家族蛋白含量以及細(xì)胞侵襲力的影響，闡明TNF-α影響細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人原發(fā)性肝癌細(xì)胞系HepG-2，人高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞系SMMC-7721購(gòu)自南京KeyGEN公司；CD15、CD15s鼠抗人單克隆抗體，Matrix基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司；糖基轉(zhuǎn)移酶ST3GaL家族：ST3GaL-Ⅰ、ST3GaL-Ⅱ、ST3GaL-Ⅲ、ST3GaL-Ⅳ、ST3GaL-Ⅴ、ST3GaL-Ⅵ兔抗人多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；蛋白內(nèi)參β-Actin一抗購(gòu)自Santa Cruz公司；羊抗兔IgG-HRP、羊抗鼠IgG-HRP、羊抗鼠IgM-HRP購(gòu)自博士德公司；凱基全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天公司；蛋白彩虹Marker購(gòu)自Fermentas公司；ECL發(fā)光反應(yīng)試劑盒購(gòu)自Thermo公司；人重組TNF-α購(gòu)自美國(guó)Promega公司；Transwell購(gòu)自Millipore公司（24孔，8 μm孔徑）；RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)HyClone Laboratorles公司；優(yōu)級(jí)胎牛血清購(gòu)自天津市灝洋生物制品科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：用RPMI 1640培養(yǎng)基（含10%優(yōu)級(jí)胎牛血清、青霉素、鏈霉素100 U/mL），在37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)HepG-2和SMMC-7721細(xì)胞系。每2~3 d用0.25%胰酶細(xì)胞傳代1次。

1.2.2 Western blot檢測(cè)：用 20 ng/mLTNF-α 處理對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG-2及SMMC-7721細(xì)胞系0、24、48 h，提取細(xì)胞全蛋白，取40 μg行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉TBS封閉1 h，CD15、CD15s、ST3GaL糖基轉(zhuǎn)移酶家族蛋白一抗溶液（稀釋200~1 000倍）室溫下振蕩孵育2 h，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗溶液（稀釋5 000倍），室溫下振蕩孵育1.5 h。ECL發(fā)光反應(yīng)，照相分析，采用Quantity One軟件分析灰度值，β-actin用作內(nèi)參照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 Transwell法：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG-2、SMMC-7721細(xì)胞，接種于6孔板（2×104/孔），24 h貼壁后換液，加入含 TNF-α（終濃度 20 ng/mL）的培養(yǎng)基，24 h和48 h后，用膠原酶消化，離心洗滌并重懸于無(wú)血清培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105/mL，取200 μL接種于Transwell小室的上室（24孔板），下室加入含10%新生小牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液，置37℃、5%CO2濕化孵箱中培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，棉簽擦凈Transwell膜上室面細(xì)胞，4%多聚甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色25 min，200倍光鏡下計(jì)數(shù)上、下、左、右、中5個(gè)不同視野穿過膜的細(xì)胞數(shù)，取均值，以遷移的細(xì)胞數(shù)表示腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。設(shè)3個(gè)平行小室，重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，Transwell實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用單因素方差分析進(jìn)行比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TNF-α對(duì)HepG-2細(xì)胞中CD15和CD15s含量的影響

用 TNF-α 分別作用 HepG-2細(xì)胞 24、48 h，CD15含量逐漸下降，CD15 s含量逐漸上升，變化呈時(shí)間依賴性。與0 h組比較，48 h組CD15含量明顯下調(diào)（P<0.05），CD15s含量明顯上調(diào)（P<0.05）。見圖1。

2.2 TNF-α對(duì)SMMC-7721細(xì)胞中CD15及 CD15s含量的影響

TNF-α分別作用SMMC-7721細(xì)胞24 h和48 h，CD15及CD15s含量較0 h組均無(wú)明顯變化（P>0.05）。見圖 2。

2.3 TNF-α對(duì)HepG-2細(xì)胞中ST3GaL糖基轉(zhuǎn)移酶家族蛋白表達(dá)的影響

TNF-α作用HepG-2細(xì)胞48 h，ST3GaL糖基轉(zhuǎn)移酶家族蛋白（Ⅰ~Ⅳ）中ST3GaL-Ⅱ和ST3GaL-Ⅳ的表達(dá)較對(duì)照組明顯上調(diào)（P<0.05），其他4種ST3GaL糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)無(wú)明顯變化（P>0.05）。見圖3。

2.4 TNF-α對(duì)HepG-2和SMMC-7721細(xì)胞侵襲力的影響

Transwell結(jié)果顯示：TNF-α作用24 h組HepG-2細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)（61.7±10.4）略高于無(wú)藥物處理對(duì)照組（48.3±5.77），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；TNF-α作用48 h組HepG-2細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)（106.7±17.56）明顯高于無(wú)藥物處理對(duì)照組（48.3±5.77），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示此時(shí)HepG-2細(xì)胞侵襲力顯著增強(qiáng)。見圖4A。

TNF-α作用24 h組及48 h組SSMC-7721細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)（100±11.36，105±13.23）較無(wú)藥物處理組穿膜細(xì)胞數(shù)（90±10.0）均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。見圖 4B。

3 討論

細(xì)胞黏附分子作為介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞或細(xì)胞與基質(zhì)相互識(shí)別和作用的分子，在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著雙重作用：一方面腫瘤細(xì)胞首先通過黏附分子表達(dá)下調(diào)，從原發(fā)灶脫落，另一方面又需要通過細(xì)胞外基質(zhì)受體或內(nèi)皮細(xì)胞配體的表達(dá)上調(diào)，與細(xì)胞外基質(zhì)或血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附而移動(dòng)，才能發(fā)生轉(zhuǎn)移［12，13］。研究表明，細(xì)胞黏附分子的表達(dá)易受細(xì)胞因子的作用。細(xì)胞因子TNF-α可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞，如乳腺癌、胰腺癌等的細(xì)胞黏附分子CD44的表達(dá)上調(diào)［11，14］。本研究首次發(fā)現(xiàn)：TNF-α 同樣可使原發(fā)性肝癌細(xì)胞系HepG-2中細(xì)胞黏附分子CD15s含量增加，同時(shí)使CD15含量下降。CD15和CD15s需要經(jīng)過1個(gè)共同的前體并通過2條途徑分別合成［15］，而ST3GaL糖基轉(zhuǎn)移酶家族蛋白在催化CD15s的生物合成中起重要作用［6，16］。為了進(jìn)一步探討TNF-α誘導(dǎo)CD15及CD15s含量變化的原因，我們應(yīng)用Western blot檢測(cè)了TNF-α作用后HepG-2細(xì)胞系中ST3GaL糖基轉(zhuǎn)移酶家族蛋白相關(guān)成員的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ST3GaL-Ⅱ和ST3GaL-Ⅳ表達(dá)明顯上調(diào)，而其他成員的表達(dá)無(wú)明顯改變。我們推測(cè)ST3GaL-Ⅱ和ST3GaL-Ⅳ的上調(diào)可能使前體偏向CD15s生物合成途徑，增加了CD15s含量，同時(shí)偏離CD15合成途徑使CD15的合成減少。本研究結(jié)果還顯示，SMMC7721細(xì)胞中CD15和CD15s的含量無(wú)明顯改變，推測(cè)其原因可能是由于該細(xì)胞中CD15和CD15s含量已接近飽和狀態(tài)。

腫瘤微環(huán)境中低劑量的TNF-α能促進(jìn)卵巢癌、人類黑色素瘤等多種腫瘤細(xì)胞侵襲［9，10］。本研究發(fā)現(xiàn)，HepG-2細(xì)胞中，TNF-α在誘導(dǎo)CD15和CD15s含量變化的同時(shí)，能促進(jìn)細(xì)胞侵襲；但在SMMC-7721細(xì)胞中，TNF-α作用后，無(wú)論是CD15和CD15s含量還是細(xì)胞侵襲力均無(wú)明顯改變。通過比較我們推測(cè)TNF-α誘導(dǎo)CD15s上調(diào)及CD15下調(diào)可能是其促進(jìn)肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞中CD15表達(dá)異常導(dǎo)致細(xì)胞黏附的改變是介導(dǎo)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要機(jī)制［17］，CD15s上調(diào)則與腫瘤侵襲呈明顯正相關(guān)［18，19］。谷化平等［20］發(fā)現(xiàn)，在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中，CD15s陽(yáng)性率為90.2%，顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（67.4%，P<0.05），提示CD15s對(duì)判斷腫瘤惡性程度和預(yù)測(cè)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況是一個(gè)具有實(shí)用價(jià)值的標(biāo)志物。

綜上所述，本研究結(jié)果提示：TNF-α可提高原發(fā)性肝癌細(xì)胞系HepG-2細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力，調(diào)控HepG-2中CD15和CD15s的含量，使CD15s上調(diào)，CD15下調(diào)。而TNF-α通過何種途徑調(diào)控CD15及CD15s含量變化進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚不明確。我們將進(jìn)一步探討相關(guān)機(jī)制，為臨床上研發(fā)新的抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的靶向藥物提供理論依據(jù)。

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