李旭，李巖，程世孝，李雷明，孟凡賀，朱悅，范廣宇

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，沈陽 1 1 0 0 0 1）

骨肉瘤是好發(fā)于青少年的常見原發(fā)性惡性骨腫瘤。盡管隨著新輔助化療、保肢體手術(shù)等綜合治療手段的開展，治療成績不斷提高，但是仍有30%～40%的患者在接受初期大劑量輔助化療后出現(xiàn)不伴有遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移的局部復(fù)發(fā)，考慮為腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)耐藥導(dǎo)致預(yù)后不良所致［1，2］。因此，在抗腫瘤治療策略研發(fā)進(jìn)程中，尋找具有抗腫瘤活性同時(shí)又能夠?qū)股踔聊孓D(zhuǎn)多藥耐藥活性的藥物受到人們關(guān)注。前期研究表明，細(xì)胞周期蛋白激酶抑制劑flavopiridol可以有效抑制尤文肉瘤敏感細(xì)胞株以及耐藥細(xì)胞株的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡［3，4］。本研究中，我們觀察該藥物在體外、體內(nèi)對骨肉瘤耐藥細(xì)胞MG63/ADR的細(xì)胞增殖抑制效果及機(jī)制，旨在為細(xì)胞周期蛋白激酶抑制劑（cyclin dependent kinase inhibitor，CDKI）抑制骨肉瘤的耐藥及復(fù)發(fā)提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 試劑與儀器

Flavopiridol（由美國Aventis公司Jose-Ramon博士惠贈）以二甲基亞砜（DMSO，Sunland-chem公司）溶解，-20℃冰凍保存，保存初始濃度為10 mmol/L。RPMI培養(yǎng)液、小牛血清（美國Gibco公司）、噻唑藍(lán)（MTT，Genview 公司）、碘化丙錠（PI，Sigma公司）、Triton-X100（Quantum公司）。

1．2 靶細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)

骨肉瘤敏感細(xì)胞株MG63及骨肉瘤耐藥細(xì)胞株（MG63/ADR）為阿霉素（adriamycin，ADM）誘導(dǎo)的P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）及多藥耐藥蛋白1（multidrug resistance protein1，MRP1）超表達(dá)的骨肉瘤多藥耐藥細(xì)胞［5］，為日本Kyushu大學(xué)小田義直教授贈與。將MG-63/ADR細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的細(xì)胞培養(yǎng)液，在37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，隔日換液，用含0.125%胰酶和0.02%EDTA消化液隔天消化、傳代，定期添加ADM（100 ng/mL）以維持P-gp高表達(dá)。

1．3 細(xì)胞增殖活性測定

將MG63及MG63/ADR細(xì)胞濃度調(diào)整為1×107/L，轉(zhuǎn)入96孔板培養(yǎng)，100 μL/孔，24 h后，加入細(xì)胞和同等稀釋度的DMSO為陰性對照組，ADM組濃度分別為 10，100，1 000，2 000，4 000，10 000，20 000，40 000，100 000 ng/mL，flavopiridol組濃度分別為 5，10，20，40，80，160，320，640，1280，2 560，5 120，10 240 nmol/L，9孔/組，每隔 24 h終止培養(yǎng) 3孔，72 h后結(jié)束全部實(shí)驗(yàn)。結(jié)束培養(yǎng)前每孔加入MTT 20 μL（濃度為5 g/L），置入培養(yǎng)箱3~4 h后離心，去上清液，加入 DMSO，每孔 200 μL，遮光下低速振蕩 10 min，在酶聯(lián)檢測儀測定各組570 nm處OD值，描繪細(xì)胞增殖曲線，計(jì)算細(xì)胞生長抑制率、藥物的IC50及耐藥倍數(shù)。細(xì)胞生長抑制率=1-（Aflavopiridol組-A空白組）/（AADM組-A空白組）×100%；耐藥倍數(shù)=IC50耐藥細(xì)胞/IC50敏感細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 細(xì)胞周期測定

實(shí)驗(yàn)組和陰性對照組各設(shè)3個平行培養(yǎng)皿。Flavopiridol作用48 h后（濃度分別為100 nmol/L，200 nmol/L，400 nmol/L），每組收集 5×105個細(xì)胞，PBS液漂洗離心后，加入70%冷乙醇4℃固定至少24 h，檢測前0.5%TritonX-100及RNase酶處理，調(diào)細(xì)胞數(shù)至1×105/mL，加入PI染色液1 mL，37℃孵育30 min，4℃染30 min，于流式細(xì)胞儀上測定細(xì)胞周期，數(shù)據(jù)經(jīng)LvsisⅡ軟件收集并分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 免疫印跡法測定

檢測給藥后 pro-caspase-9、pro-caspase-3、caspase-8、Bcl-2、Bcl-xL、p53、Bax以及 cleaved-PARP 表達(dá)水平的變化。收集對照組和經(jīng)不同濃度flavopiridol處理48 h的細(xì)胞（濃度分別為100 nmol/L，200 nmol/L，400 nmol/L），以細(xì)胞裂解液裂解，提取蛋白并定量后，分別取50 μg加入上樣緩沖液，經(jīng)95℃變性10 min，8%～12%的聚丙烯酰胺-SDS凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h后，加一抗室溫孵育2 h；TBST洗滌3次，每次10 min，二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記，1∶2 000稀釋）室溫孵育2 h；TBST洗滌3次，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑后放入暗盒中壓片并依次顯影、固定、照相。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 裸小鼠皮下種植瘤模型制作

取5周齡BALB/C裸鼠30只，制備細(xì)胞懸液（2×108/mL），每只裸鼠背部皮下注射細(xì)胞懸液0.1 mL。8 d后27只小鼠出現(xiàn)皮下結(jié)節(jié)（直徑5～6 mm）。將造模成功裸鼠隨機(jī)分為對照組（9只），5 mg·kg-1·d-1組（9只）和7.5 mg·kg-1·d-1組（9只），實(shí)驗(yàn)組分別每天腹腔內(nèi)注射flavopiridol（5 mg/kg和7.5 mg/kg），對照組注射同體積PBS緩沖液，連續(xù)5 d。每3天測量1次腫瘤長徑（a）和短徑（b），計(jì)算腫瘤體積：V=a×b2/2。成瘤后觀察4周，繪制腫瘤生長曲線。腫瘤生長抑制率=（1-處理組瘤質(zhì)量/對照組瘤質(zhì)量）×100%。并每周測量裸鼠體質(zhì)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 10.0軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示。采用單因素方差分析（ANOVA），P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Flavopiridol對骨肉瘤耐藥細(xì)胞增殖影響

MTT試驗(yàn)結(jié)果顯示，ADM對敏感細(xì)胞的IC50為220 ng/mL，對耐藥細(xì)胞的IC50為3 100 ng/mL，其耐藥倍數(shù)為14.1倍。而flavopiridol對敏感細(xì)胞及耐藥細(xì)胞的IC50分別為160 nmol/L和185 nmol/L，耐藥倍數(shù)僅為1.15倍，其中flavopirdol能有效抑制MG63/ADR細(xì)胞增殖（表1）。

2.2 Flavopiridol對骨肉瘤耐藥細(xì)胞MG-63/ADR細(xì)胞周期的影響

如表2所示，F(xiàn)lavopiridol作用MG63/ADR細(xì)胞后，對照組 Sub-G1期為（4.42±0.25）%，實(shí)驗(yàn)組 Sub-G1期比率隨flavopiridol給藥濃度增加而逐漸上升，各實(shí)驗(yàn)組與對照組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而G0/G1期比率在低濃度（100 nmol/L）給藥時(shí)較對照組上升，當(dāng)濃度上升至200 nmol/L以上時(shí)則明顯下降，與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

表1 F l a v o p i r i d o l對骨肉瘤耐藥細(xì)胞MG 6 3/A D R的抑制率（%）Tab.1 Effect of flavopiridol on proliferation of MG63/ADR cells（%）

表2 F l a v o p i r i d o l給藥后骨肉瘤耐藥細(xì)胞MG 6 3/A D R的細(xì)胞周期分布（%）Tab.2 Effect of flavopiridol on apoptosis and cell cycle of MG63/ADR cells（%）

2.3 Flavopiridol對耐藥細(xì)胞中細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果顯示，耐藥細(xì)胞株中的pro-caspase-9、procaspase-3、Bcl-2以及Bcl-xL的表達(dá)下降，活化型caspase-8、PARP-85的表達(dá)增加，其效應(yīng)具有劑量相關(guān)性，而p53及Bax的表達(dá)無變化（圖1）。

2.4 裸小鼠體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在falvopiridol連續(xù)給藥5 d后，實(shí)驗(yàn)組和對照組腫瘤體積從第12天起各觀測時(shí)點(diǎn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。抑瘤率分別為 68.0%（5 mg·kg-1·d-1組）和 89.1%（7.5 mg·kg-1·d-1組），與對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。給藥2周后小鼠體質(zhì)量各實(shí)驗(yàn)組與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，表 3）。

3 討論

Flavopiridol作為一種新發(fā)現(xiàn)的小分子CDKI，最初來源于一種印度植物的莖皮提取液，其分子量約401.84。既往在針對食道癌、非小細(xì)胞肺癌及前列腺癌的抗腫瘤藥物篩選中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)lavopiridol可在體內(nèi)外明顯抑制增殖，其主要機(jī)制為通過抑制CDK2及CDK4/6激酶活性，抑制cyclinD1的基因表達(dá)，抑制真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄延伸因子P-TEFb的活性，以及下調(diào)NO合酶的活性等機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，相關(guān)藥物的應(yīng)用研究已經(jīng)進(jìn)入臨床Ⅱ期實(shí)驗(yàn)，與其他藥物的聯(lián)合應(yīng)用也已進(jìn)入臨床Ⅲ期實(shí)驗(yàn)，具有較為廣闊的應(yīng)用前景［6，7］。本實(shí)驗(yàn)所選用的耐阿霉素人骨肉瘤細(xì)胞株MG63/ADR細(xì)胞是一株典型的MDR細(xì)胞系，可以檢測到穩(wěn)定的P-gp及MRP1高表達(dá)，可對ADM及其他多種化學(xué)結(jié)構(gòu)及功能完全不同的抗腫瘤藥物產(chǎn)生交叉耐藥［5］。而既往研究表明flavopiridol在結(jié)構(gòu)上存在特異表型，可成為P-gp底物，從而對抗P-gp對多數(shù)抗腫瘤藥物所發(fā)揮的外排功能，即從結(jié)構(gòu)上天然可對抗P-gp介導(dǎo)的耐藥發(fā)生，此外還可作為多藥耐藥另一重要因子——ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)載體蛋白MPR1的調(diào)節(jié)劑［8］，對抗由MPR1所導(dǎo)致的多藥耐藥，從而對多藥耐藥細(xì)胞有效地發(fā)揮其細(xì)胞增殖抑制作用。盡管該假說在前列腺癌、肺癌的抗腫瘤耐藥機(jī)制中已得以驗(yàn)證，但CDKI對原發(fā)性惡性骨腫瘤耐藥細(xì)胞的增殖抑制作用卻鮮見報(bào)道。本研究結(jié)果表明，flavopiridol可有效抑制骨肉瘤敏感株及耐藥株細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，耐藥株與非耐藥株的IC50濃度相近，提示flavopiridol在應(yīng)用于骨肉瘤治療時(shí)與阿霉素等經(jīng)典的抗腫瘤藥物不發(fā)生交叉耐藥。細(xì)胞周期分析及Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)一步表明flavopiridol在高濃度時(shí)主要是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制耐藥骨肉瘤細(xì)胞的增殖。裸鼠移植瘤的動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示flavopiridol可于體內(nèi)有效抑制骨肉瘤耐藥細(xì)胞的增殖。

表3 F l a v o p i r i d o l對裸鼠移植瘤生長的抑制作用比較（x±s，mm3）Tab.3 Antiproliferative effects of flavopiridol on MG63/ADR cells in vivo（x±s，mm3）

細(xì)胞凋亡又稱細(xì)胞程序性死亡，迄今為止的研究表明，細(xì)胞凋亡的主要通路有線粒體通路、死亡受體通路及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路。細(xì)胞凋亡通路在耐藥機(jī)制研究中，線粒體凋亡通路的誘導(dǎo)占有十分重要的地位。而在線粒體凋亡通路中，Bcl-2家族成員發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，該家族成員中Bax、PUMA、Noxa、Bid、Bcl-2等相當(dāng)一部分的因子是p53蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的下游靶基因。Bcl-2是細(xì)胞凋亡研究中最受重視的癌基因之一，其抗凋亡Bcl-2家族成員（Bcl-2、BclxL）的過度表達(dá)利于細(xì)胞的生存，是阻斷細(xì)胞凋亡的最后共同通路的關(guān)鍵蛋白，與凋亡逃避和化療抗藥性密切相關(guān)；而促凋亡Bcl-2家族成員（Bax和Bak）和 BH3 惟一蛋白（Bid、Bim、Bik、PUMA、Noxa）的活性增加則可提高惡性細(xì)胞對凋亡的敏感性，從而克服藥物耐受［9］。在p53野生型細(xì)胞中，抗腫瘤藥物所導(dǎo)致的Bax/Bcl-2比例的升高是細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的常見變化之一。而在本研究中所使用的MG63/ADR細(xì)胞為p53突變型細(xì)胞株，細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的免疫印跡分析結(jié)果表明，flavopiridol給藥后p53及其下游靶因子Bax的表達(dá)無變化，而Bcl-2及Bcl-xL的表達(dá)被下調(diào)，提示其可能通過其他的非p53依賴的線粒體激活路徑發(fā)揮了促細(xì)胞凋亡的效果［10，11］。caspase是一種門冬氨酸依賴性的半胱氨酸蛋白酶，在細(xì)胞凋亡中起著不可替代的重要調(diào)控作用。caspase通路是諸多調(diào)控通路的關(guān)鍵，各凋亡通路最后都有caspase的激活。此外，P-gp還具有抑制細(xì)胞caspase依賴性凋亡的作用。細(xì)胞的凋亡分為caspase依賴性和非依賴性兩種，P-gp對非依賴性細(xì)胞凋亡沒有抑制作用，但P-gp的高表達(dá)能抑制由細(xì)胞毒藥物、自由基以及放射線等因素引起的caspase依賴性凋亡［12］。曾有研究表明，caspase-3、caspase-8 和caspase-9的激活通路的功能抑制可能是P-gp參與細(xì)胞耐藥發(fā)生的作用機(jī)制之一［13］。本研究結(jié)果顯示在耐藥骨肉瘤細(xì)胞中導(dǎo)入flavopiridol后，caspase-3、caspase-8及caspase-9的表達(dá)可能被再度激活，從而抵消了P-gp對3者的激活抑制作用，進(jìn)而增強(qiáng)促耐阿霉素骨肉瘤細(xì)胞凋亡的效果。

綜上所述，本研究通過體外及體內(nèi)的聯(lián)合實(shí)驗(yàn)確認(rèn)flavopiridol可明顯抑制人耐阿霉素骨肉瘤細(xì)胞株MG63/ADR的增殖，其具體機(jī)制可能為通過激活非p53依賴的線粒體信號傳導(dǎo)通路以及誘導(dǎo)MG63/ADR細(xì)胞凋亡及激活死亡受體介導(dǎo)的caspase信號傳導(dǎo)途徑。這為未來臨床應(yīng)用小分子CDKI治療耐藥性的骨肉瘤患者提供了新的有力的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

［1］Hawkins DS，Arndt CA.Pattern of disease recurrence and prognostic factors in patients with osteosarcoma treated with contemporary chemotherapy［J］.Cancer，2003，98（11）：2447-2456.

［2］Janeway KA，Grier HE.Sequelae of osteosarcoma medical therapy：a review of rare acute toxicities and late effects.［J］.Lancet Oncol，2010，11（7）：670-678.

［3］Li X，Tanaka K，Nakatani F，et al.Transactivation of cyclin E gene by EWS-Fli1 and antitumor effects of cyclin dependent kinase inhibitor on Ewing’s family tumor cells［J］.Int J Cancer，2005，116（3）：385-394.

［4］范姝麗，李旭，林杰，等.Flavopiridol誘導(dǎo)耐阿霉素尤文肉瘤細(xì)胞株VH-64/ADR凋亡及作用機(jī)制的研究［J］.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2009，17（8）：1407-1410

［5］Okada T，Tanaka K，Nakatani F，et al.Involvement of P-glycoprotein and MRP1 in resistance to cyclic tetrapeptide subfamily of histone deacetylase inhibitors in the drug-resistant osteosarcoma and Ewing’s sarcoma cells［J］.Int J Cancer，2006，118（1）：90-97.

［6］Billard C，Menasria F，Quiney C，et a1．Flavopiridol-induced iN0S downregulation during apoptosis of chronic lym phocytic leukemia cells is caspase-dependent［J］.Leuk Res，2008，32（5）：755-760.

［7］Dickson MA，Schwartz GK.Development of cell-cycle inhibitors for cancer therapy［J］.Curr Oncol，2009，16（2）：36-43.

［8］Bansal T，Jaggi M，Khar RK，et al．Emerging significance of flavonoids asP-glycoproteininhibitorsincancerchemotherapy［J］．JPharmPharm Sci，2009，12（1）：46-78.

［9］Krishna S，Low IC，Pervaiz S．Regulation of mitochondrial metabolism：yet another facet in the biology of the oncoprotein Bcl-2［J］．Biochem J，2011，435（3）：545-551．

［10］Rosato RR，Almenara JA，Kolla SS．Mechanism and functional role of XIAP and Mcl-1 down-regulation in flavopiridol/vorinostat antileukemic interactions［J］.Mol Cancer Ther，2007，6（2）：692-702．

［11］Huang JM，Sheard MA，Ji L，et al．Combination of vorinostat and flavopiridol is selectively cytotoxic to multidrug-resistant neuroblastomacelllineswithmutantTP53 ［J］.MolCancerTher，2010，9（12）：3289-3301.

［12］Ruefli AA，Johnstone RW.A role for P-glycoprotein in regulating cell growth and survival［J］.Clin App Immunol，2003（4）：31-47.

［13］Johnstone RW，Ruefli AA，Tainton KM，et al.A role for P-glycoprotein in regulating cell death［J］.Leuk Lymphoma，2000，38（1-2）：1-11.