陳忠敏，羅 琴，張瑤琴，劉 瓊

(重慶理工大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054)

絲膠蛋白的細(xì)胞相容性和抗菌性能研究

陳忠敏，羅 琴，張瑤琴，劉 瓊

(重慶理工大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054)

研究了從繭殼、繭衣中提取絲膠蛋白(S1、S2)及繭殼絲膠進(jìn)行酶解制備的小分子絲膠蛋白肽(S3)的細(xì)胞相容性，以及對革蘭氏陰性菌、陽性菌的抗菌作用。結(jié)果表明：三種絲膠蛋白均“對細(xì)胞無毒性”，并隨絲膠濃度的增大對細(xì)胞生長有促進(jìn)作用。采用細(xì)菌生長抑制試驗定量測試了各梯度濃度下絲膠的抑菌率，結(jié)果顯示絲膠具有顯著的抑菌作用，對金黃色葡萄球菌和的大腸桿菌抑制率由大到小依次為S3、S1、S2和S2、S3、S1，絲膠濃度對抑菌性有一定影響。研究結(jié)果表明絲膠是一種具有良好抑菌性能的生物相容性材料。

絲膠蛋白；細(xì)胞相容性；抗菌性

近年來，絲膠作為生物材料的應(yīng)用研究日趨活躍，閻隆飛、陳華等[1-2]的研究指出絲膠的降解性、凝膠-溶膠轉(zhuǎn)化特性等優(yōu)于絲素蛋白，可作為一些特定范圍內(nèi)的生物材料加以應(yīng)用。絲膠蛋白作為一種球狀蛋白質(zhì)，具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)、獨特的生物活性和環(huán)境易變性[3]，所以在關(guān)于絲膠應(yīng)用的研究報告中一般均注明了所用絲膠的制備條件。張瑤琴等[4]研究了絲膠蛋白結(jié)構(gòu)與制備條件的相關(guān)性，指出不同制備方法獲得絲膠蛋白的氨基酸組成、相對分子質(zhì)量、分子構(gòu)象、溶解性等均存在差異。而研究人員更多的興趣在于不同形狀的絲膠蛋白是否具有免疫原性而影響細(xì)胞、組織，絲膠基礎(chǔ)分子形態(tài)構(gòu)象變化、相對分子質(zhì)量大小變化和細(xì)胞相容性具有怎樣的相關(guān)性等方面的問題[5-6]。

本研究在張瑤琴等[4]研究的基礎(chǔ)上，按照文獻(xiàn)[4]采用的水煮脫膠法分別從繭殼、繭衣中提取絲膠蛋白(S1、S2)，將部分繭殼絲膠酶解得到小分子絲膠蛋白肽(S3)。樣本采用MTT法細(xì)胞毒性檢測對比了各組絲膠樣本對L-929小鼠成纖維細(xì)胞的相對增殖率(RGR，%)，觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，評價細(xì)胞毒性。同時進(jìn)行了體外抑菌定量試驗，以獲取絲膠抗菌性能，進(jìn)一步探明其作為生物材料的應(yīng)用可行性。

1 材料與方法

1.1 材 料

繭殼、繭衣(重慶市纖維織品檢驗所)，中性蛋白酶(南寧龐博生物有限公司)，金黃色葡萄球菌、大腸桿菌(重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物實驗室)，L-929細(xì)胞(重慶第三軍醫(yī)大學(xué))。

所用試劑均為市售分析純。MTT(Scientific Research Specialic)、胰蛋白酶(Sigma進(jìn)口分裝)、小牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)、RPMI-1640培養(yǎng)基(HyClone，賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司)、濾頭(Millipore，Ireland)、96孔板(Costor，USA)、塑料培養(yǎng)瓶(Corning，USA)、血球計數(shù)板。

1.2 試 驗

1.2.1 三種絲膠樣品的制備

按照文獻(xiàn)[4]的方法，分別從繭殼和繭衣中提取絲膠蛋白(S1，S2)：用蒸餾水將繭殼或繭衣清洗晾干，用適量的乙醚浸泡48 h(24 h換一次乙醚)除蠟質(zhì)物，洗凈、攤晾干燥；將干燥的繭殼和繭衣用無水乙醇在室溫下浸泡24 h除去部分有機物和雜質(zhì)，蒸餾水洗凈后室溫下攤晾干燥后，分別將繭殼和繭衣放入蒸餾水中煮沸脫膠，取小樣用苦味酸胭脂紅檢測，至繭絲變黃即絲膠脫凈。將所得絲膠溶液，經(jīng)濃縮、冷凍干燥后得絲膠蛋白粉末備用。

按照文獻(xiàn)[7]的方法，將經(jīng)上述方法從繭殼中提取的絲膠，用中性蛋白酶酶解制備小相對分子質(zhì)量絲膠蛋白肽(S3)。

通過SDS-PAGE法分別測定從繭殼、繭衣中提取絲膠蛋白的相對分子質(zhì)量，采用Tricine-SDS-PAGE法測定酶解繭殼絲膠的蛋白肽相對分子質(zhì)量。

1.2.2 L-929細(xì)胞相容性試驗

用含小牛血清10 %的RPMI-1640培養(yǎng)基將絲膠S1、S2、S3分別配成0.5、0.1、0.02 mg/mL三種質(zhì)量濃度，用于培養(yǎng)L-929小鼠成纖維細(xì)胞。將細(xì)胞濃度為2×104個/mL的L-929細(xì)胞懸液加入96孔板中，每孔加入100 μL。待細(xì)胞貼壁后，將96孔板孔內(nèi)液體吸走，然后每孔加入200 μL上述準(zhǔn)備好的含各試驗組絲膠的培養(yǎng)基，并以只加培養(yǎng)基的孔為空白對照組，每試驗組設(shè)5個復(fù)孔，在37℃，5 %CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用5塊96孔板分別培養(yǎng)24，48，72，96，120 h。

待培養(yǎng)到相應(yīng)的時間點時，從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)板，采用倒置顯微鏡(XDS-1B，重慶光電儀器總公司)觀察細(xì)胞的生長形態(tài)，并采用MTT法處理試樣：每孔加入5 g/L MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，加入二甲基亞砜(DMSO)150 μL，震蕩10 min，用TECAN酶標(biāo)儀 SUNRISE(A-5082，Austria)在490 nm處測定吸光度值，繪制細(xì)胞生長曲線，并計算細(xì)胞的相對增殖率(RGR)[8]。

細(xì)胞毒性分級標(biāo)準(zhǔn)如下：RGR≥100，0級；75≤RGR＜100，1級；50≤RGR＜75，2級；25≤RGR＜50，3級；1＜RGR＜25，4級；RGR＝0，5級。

1.2.3 抑菌性能測試

配置肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，置121 ℃高壓滅菌鍋中滅菌30 min，待培養(yǎng)基冷卻至50 ℃，倒平板，制成固體培養(yǎng)基待用。將S1、S2、S3分別配成50，10，2 mg/mL三種質(zhì)量濃度梯度樣品備用。

準(zhǔn)確吸取經(jīng)活化的大腸桿菌及金黃色葡萄球菌菌液，分別稀釋到10－4，10－5，10－6，10－7，10－8，10－9，取各濃度的菌液50 μL在平板上均勻涂布。放入恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，至菌落長出來后進(jìn)行計數(shù)。則樣品的菌數(shù)/mL＝同一稀釋度4次重復(fù)的菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)×20，找到最適合的菌液濃度，平板上菌落數(shù)在50～120 cfu為宜。本次試驗以稀釋到10－5計數(shù)最宜。

將50 μL的10－5菌液和100 μL的各濃度梯度的樣品加入倒好培養(yǎng)基的平板上均勻涂布，以只涂布菌懸液的平板為空白對照。待液體完全吸收后在37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，至菌落長出后進(jìn)行計數(shù)。每組進(jìn)行3次重復(fù)試驗，并以抑菌率來評價各絲膠樣的抑菌性能。

2 結(jié)果與討論

2.1 絲膠蛋白質(zhì)制備

通過SDS-PAGE凝膠電泳，確認(rèn)了繭殼中提取絲膠S1的相對分子質(zhì)量分布在66.2～130 kDa，繭衣中提取絲膠S2的相對分子質(zhì)量在43～130kDa，Tricine-SDSPAGE凝膠電泳測得繭殼提取絲膠酶解后相對分子質(zhì)量在3 kDa以下，這與張瑤琴等[4]研究所得結(jié)果一致。

2.2 細(xì)胞相容性試驗

L-929細(xì)胞，即小鼠成纖維細(xì)胞，是國家標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞相容性測試時使用細(xì)胞。試驗中，在含有各類絲膠的培養(yǎng)基中培養(yǎng)了1，2，3，4，5 d的細(xì)胞形態(tài)與對照組的細(xì)胞形態(tài)基本相同，呈梭形或三角形，貼壁良好，生長旺盛，如圖1所示。

圖1 L-929細(xì)胞在含有不同絲膠(0.5 mg/mL)的培養(yǎng)基中生長3 d的倒置顯微鏡照片F(xiàn)ig.1 Inverted microphotograph of L-929 cells growing on culture medium with different sericin (0.5 mg/mL) for 3d

圖2A、B、C分別為L-929細(xì)胞在含各種絲膠樣本S1、S2、S3培養(yǎng)基的生長曲線。由圖2可見：各試驗組細(xì)胞的生長趨勢與對照組基本一致；對繭殼提取絲膠蛋白，隨著S1質(zhì)量濃度的增大，吸光度值變小，0.5 mg/mL的S1吸光度值低于對照組，對細(xì)胞生長有細(xì)微影響；而各質(zhì)量濃度的S2和S3的吸光度值均高于對照組，表現(xiàn)出對細(xì)胞有較強促生長作用，且隨質(zhì)量濃度的增大促進(jìn)作用越明顯。

MTT法用來評價各組絲膠的細(xì)胞毒性。表1計算了各試驗組絲膠對L-929細(xì)胞的相對增殖率和毒性評分。由表1可見，5 d內(nèi)，S1的細(xì)胞毒性評分隨其質(zhì)量濃度的增大從0級增至1級，高質(zhì)量濃度的S1對細(xì)胞生長有微小影響，但均在2級以下，未造成細(xì)胞毒性；而各質(zhì)量濃度的S2和S3的RGR均大于100，毒性評分均為0級，有促細(xì)胞生長作用，且隨質(zhì)量濃度的增大，促生長作用更好。這說明絲膠蛋白生物相容性良好，具有在生物材料領(lǐng)域開發(fā)應(yīng)用的前景。

2.3 抑菌性能測試

對于生物材料來說，具備抗菌性能將在其應(yīng)用過程中更為有利。絲膠蛋白質(zhì)是蠶繭繭殼的一部分，其生理性功能是保護(hù)蠶蛹度過孵化成蛾時期。絲膠蛋白質(zhì)在一定程度上能夠抗拒外界惡劣環(huán)境，包括細(xì)菌侵入等，由此推定其應(yīng)具備抗菌性能。圖3、圖4為不同質(zhì)量濃度絲膠蛋白質(zhì)對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的抗菌試驗。

圖2 L-929細(xì)胞在含不同質(zhì)量濃度的各絲膠樣培養(yǎng)基中的生長曲線Fig.2 Growth curves of L-929 cells cultured in the medium containing different concentrations of sericin

從圖3、圖4可知，各組絲膠蛋白對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都有抑菌效果，而且隨著質(zhì)量濃度增大，抑菌率呈現(xiàn)先增大后降低趨勢，說明絲膠具備抗菌性，而其抗菌效果與質(zhì)量濃度具有一定的相關(guān)性，但暫未發(fā)現(xiàn)其具統(tǒng)計學(xué)意義。這是因為絲膠蛋白質(zhì)是球狀蛋白質(zhì)，三級結(jié)構(gòu)中分子構(gòu)象復(fù)雜，質(zhì)量濃度相同時其構(gòu)象的變化也將影響其各方面性能。從圖3、圖4還可看出，不同環(huán)境中制得的絲膠蛋白對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的生長呈現(xiàn)不同程度的抑制作用，比較試驗中絲膠為10 mg/mL時的抗菌性，對金黃色葡萄球菌的抑制作用由強到弱順序依次為S3、S1、S2，對大腸桿菌抑制作用由強到弱順序依次為：S2、S3、S1。從這些數(shù)據(jù)可以看出，制備條件不同的絲膠，其分子構(gòu)象不同將導(dǎo)致抗菌性能的差異。

從整體效果看，絲膠對大腸桿菌的抑菌性能優(yōu)于金黃色葡萄球菌。分析原因，可能是絲膠蛋白的溶解性導(dǎo)致[4]，其在培養(yǎng)時能夠在平板中滲透，具有細(xì)菌表面接觸和內(nèi)部侵入的雙重作用，對細(xì)胞壁較厚的革蘭氏陽性細(xì)菌金黃色葡萄球菌主要表現(xiàn)為細(xì)菌表面接觸型，而對細(xì)胞壁薄的革蘭氏陰性細(xì)菌大腸桿菌則主要為表面接觸和內(nèi)部滲透，即溶解滲透性好的絲膠分子上，某些基團(tuán)先吸附在細(xì)菌表面而改變了細(xì)菌表面膜的通透性再侵入細(xì)菌內(nèi)部，與細(xì)菌體內(nèi)物質(zhì)發(fā)生吸附，擾亂細(xì)菌體內(nèi)的正常生理活動，從而起到了殺滅細(xì)菌的作用。從數(shù)據(jù)看，繭殼中提取的絲膠抗革蘭氏陽性菌的作用強于繭衣中提取的絲膠，而對革蘭氏陰性細(xì)菌的順序則相反，這可能是由于S2的溶解性大于S1[4]導(dǎo)致。相對分子質(zhì)量小的S3對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果都強于S1，這可能是因為小分子的絲膠本身具有量子效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)和相對大的比表面積等特性，使得其抗菌接觸優(yōu)于未經(jīng)酶解處理的S1。

表1 相對增殖率RGR及毒性評分結(jié)果Tab.1 Relative growth rate (RGR) and toxicity score results

圖3 絲膠對金黃色葡萄球菌的抑菌效果Fig.3 Antibacterial effects of sericin to staphylococcus aureus

圖4 絲膠對大腸桿菌的抑菌效果Fig. 4 Antibacterial effects of sericin to Escherichia coli

3 結(jié) 論

1)本研究采用水煮脫膠法分別從家蠶繭殼、繭衣中提取了絲膠蛋白(S1、S2)，用中性蛋白酶酶解部分S1，制備了相對分子質(zhì)量小的繭殼絲膠蛋白肽(S3)。細(xì)胞試驗結(jié)果表明：三種絲膠蛋白對L-929細(xì)胞的RGR毒性評分均在2級以下，顯示無毒性，且隨絲膠質(zhì)量濃度增大，促細(xì)胞生長性能更優(yōu)。S2和S3的細(xì)胞相容性略優(yōu)于S1。

2)絲膠對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有抑菌作用，對大腸桿菌的抗菌性更為顯著。隨絲膠質(zhì)量濃度增大，抑菌率有先逐漸增加后減小的趨勢。試驗表明，當(dāng)絲膠質(zhì)量濃度為10 mg/mL左右時，可發(fā)揮較好的抑菌效果。由于不同制備環(huán)境下得到的絲膠的溶解性能不同，其抗菌作用強弱有了差異，其對金黃色葡萄球菌的抑制作用強弱順序為S3、S1、S2，對大腸桿菌抑制作用強弱順序為S2、S3、S1。絲膠所具有的抗菌性能增大了其在生物材料領(lǐng)域使用的適應(yīng)性。

[1]閻隆飛，孫之榮.蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)[M].北京：清華大學(xué)出版社，2000：76-79，32-42.

YAN Longfei, SUN Zhirong. Protein Structure [M]. Beijing:Qinghua University Press, 2000: 76-79, 32-42.

[2]陳華，朱良均，閔思佳，等.蠶絲絲膠蛋白的結(jié)構(gòu)、性能及利用[J].功能高分子學(xué)報，2001，14(3)：344-348.

CHEN Hua, ZHU Liangjun, MIN Sijia, et al. Structure,property and utilization of silk sericin[J]. Journal of Functional Polymer, 2001, 14(3): 344-348.

[3]張雨青.絲膠蛋白的藥理及其在醫(yī)用材料上的應(yīng)用[J].紡織學(xué)報，2003，24(3)：98-100.ZHANG Yuqing. Pharmacological function and application to medical biomatenals of sericin[J]. Journal of Textile Research, 2003, 24(3): 98-100.

[4]張瑤琴，陳忠敏，張艷冬，等.絲膠蛋白分子結(jié)構(gòu)及其制取條件[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15(3)：468-472.

ZHANG Yaoqin, CHEN Zhongmin, ZHANG Yandong, et al.Structure and extraction conditions of sericin protein[J].Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research, 2011, 15(3): 468-472.

[5]KATO N, SATO S, YAMANAKA A, et al. Silk protein,sericin, inhibits lipid peroxidation and tryosinase activity[J].Biosci Biotechnol Biochem, 1998, 62(1): 145-147.

[6]ZHANG Y Q, MA Y, XIA Y Y, et al. Silk sericin-insulin bioconjugates: Synthesis, characterization and biological activity[J]. Journal of Controlled Release, 2006, 115(3):307-315.

[7]陳忠敏，郝雪菲，吳大洋，等.再生蠶絲絲素蛋白納米顆粒的制備及抗菌性[J].紡織學(xué)報，2008，29(7) ：17-20.

CHEN Zhongmin, HAO Xuefei, WU Dayang, et al.Preparation of silk fi broin peptide nano-scale particles and its antibacterial activity[J]. Journal of Textile Research,2008, 29(7): 17-20.

[8]張富強，佘文，傅遠(yuǎn)飛，等.六種納米載銀無機抗菌劑的體外細(xì)胞毒性比較[J].中華口腔醫(yī)學(xué)雜志，2005，40(6)：504-507.

ZHANG Fuqiang, SHE Wen, FU Yuanfei, et al. Comparison of the cytotoxicity in vitro among six types of nano-silver base inorganic antibacterial agents[J]. Chinese Journal of Stomatology, 2005, 40(6): 504-507.

Cytocompatibility and antibacterial properties of sericin proteins

CHEN Zhong-min, LUO Qin, ZHANG Yao-qin, LIU Qiong

(College of Pharmacy and Bioengineering, Chongqing University of Technology, Chongqing 400054, China)

This paper studies the cytocompatibility of sericin proteins (S1, S2) extracted from cocoon shell and cocoon outer floss respectively and small molecule sericin protein peptide (S3) prepared by enzymolysis of cocoon shell sericin, and studies the antibacterial properties against Gram-negative bacteria and Grampositive bacteria. Results show that: all these three kinds of sericin protein have not toxicity to cells, and show the function of promoting cell growth with the increase of sericin concentration. Have a quantitative test of bacterial inhibition rate of sericin under each concentration gradient by using bacterial growth inhibition test, and results show that sericin has significant antibacterial properties, and inhibition rates of Staphylococcus aureus and Escherichia coli in descending order are S3, S1, S2 and S2, S3, S1 respectively, and sericin concentration has effects on their antibacterial properties. The results suggest that sericin is a kind of biocompatible material with good antibacterial properties.

Sericin proteins; Cytocompatibility; Antibacterial properties

TS146；R318

A

1001-7003(2012)11-0001-05

2012-06-07；

2012-07-18

重慶市高等學(xué)校優(yōu)秀人才支持計劃項目(2011CQ04)；重慶理工大學(xué)研究生創(chuàng)新基金項目(YCX2011310)

陳忠敏(1968－ )，女，教授，主要從事生物材料、功能高分子材料研究。