馮 海，徐玉蕓，李宗陽(yáng)，齊陽(yáng)光，張傳兵

(1.浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，杭州 310014;2.浙江永寧制藥廠，浙江臺(tái)州 318020;3.杭州愛(ài)力邁動(dòng)物藥業(yè)有限公司，杭州 310013)

伊維菌素(Ivermectin，IVM)是阿維菌素選擇性加氫的衍生物，具有較高的安全性和穩(wěn)定性，是廣譜、高效、低毒抗生素類(lèi)抗寄生蟲(chóng)藥，對(duì)體內(nèi)外寄生蟲(chóng)特別是線蟲(chóng)和節(jié)肢動(dòng)物均有良好驅(qū)殺作用，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于抗寄生蟲(chóng)的防治［1-2］。大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗寄生蟲(chóng)藥對(duì)線蟲(chóng)及節(jié)肢動(dòng)物的驅(qū)殺作用，在于增加蟲(chóng)體的抑制性遞質(zhì)γ-氨基丁酸的釋放，以及打開(kāi)谷氨酸控制的Cl離子通道，增強(qiáng)神經(jīng)膜對(duì)Cl的通透性，從而阻斷神經(jīng)信號(hào)的傳遞，最終神經(jīng)麻痹，使肌肉細(xì)胞失去收縮能力，而導(dǎo)致蟲(chóng)體死亡。但是目前市售的伊維菌素制劑，藥效維持時(shí)間短，體外釋放半衰期約為30 h，體內(nèi)持效期約為5～21 d，生物利用度不高，頻繁過(guò)量使用導(dǎo)致動(dòng)物產(chǎn)品藥物殘留嚴(yán)重，綜合養(yǎng)殖成本增加，危害公共環(huán)境，體內(nèi)藥物濃度峰谷變化劇烈增加了寄生蟲(chóng)抗藥性產(chǎn)生的可能性，不符合安全合理的用藥原則［3-4］。所以獸用抗寄生蟲(chóng)制劑［5］急需研究更加長(zhǎng)效緩釋的類(lèi)型，減少投藥次數(shù)，降低成本，提高藥物的有效性。本文采用單凝聚法和復(fù)凝聚法分別制備了低釋放的伊維菌素微膠囊，并對(duì)其進(jìn)行了穩(wěn)定性和體外釋放度的研究，旨在提高其生物利用度，降低其毒副作用的目的，制備長(zhǎng)效緩釋的新型伊維菌素制劑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試藥 伊維菌素(杭州愛(ài)力邁動(dòng)物藥業(yè)有限公司，含量＞96%);伊維菌素對(duì)照品(由中國(guó)獸藥監(jiān)察所提供，含量＞99%);市售伊維菌素注射液(杭州愛(ài)力邁動(dòng)物藥業(yè)有限公司);明膠(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器 Spectramax M2e型多功能酶標(biāo)儀(Molecular Devices);752單光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海菁華科技儀器有限公司);JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(成都市生科儀器有限責(zé)任公司)。

1.2 方法

1.2.1 伊維菌素微膠囊的制備［6-8］單凝聚法制備工藝:取處方量明膠及表面活性劑并加入適量蒸餾水約10 g，溶脹8 h，制成溶膠。加入處方量IVM微粉，10000 r/min高速勻漿3 min。然后在 300 r/min下水浴攪拌，滴加稀鹽酸溶液至 pH值為3.0～4.5后加入適量20%無(wú)水硫酸鈉溶液，顯微鏡下觀察。冰水浴冷卻1～2 min，攪拌下倒入三倍量的10% 無(wú)水硫酸鈉稀釋液，攪拌分散，靜置沉降，稀釋液用蒸餾水洗滌1～2次，將微囊沉淀移至40 mL稀釋液中，冰水浴繼續(xù)攪拌，加適量甲醛固化2 h，靜置沉降，抽濾，沉淀用異丙醇浸洗2次，抽干備用。

復(fù)凝聚法制備工藝:稱(chēng)取處方量伊維菌素加入到3%阿拉伯膠溶液中，超聲10 min后緩慢滴入50℃等體積的3%明膠溶液中，200 r/min攪拌5 min，并同時(shí)滴加5%醋酸溶液至鏡檢觀察成囊完好，保持溶液 pH=4。加入蒸餾水80 mL以450 r/min攪拌降溫到28℃以下，冰水浴降至10℃以下，37%甲醛3 mL固化15 min，用5%NaOH溶液調(diào)節(jié)pH在8～9，冷卻，300 r/min保溫固化3 h后，用水和異丙醇2次洗去甲醛，抽干備用。

取兩種方法制得的少量微囊，在顯微鏡下觀察形態(tài)。結(jié)果顯示單凝聚法和復(fù)凝聚法制得的微囊囊形圓整，顯微鏡下觀察多為圓形球，表面較光滑，粒徑也較均勻，復(fù)凝聚法所制微囊局部有粘連，且制備方法較單凝聚法繁瑣，條件不易控制，成本較高，故選擇單凝聚法制備伊維菌素微囊并進(jìn)行工藝優(yōu)化。

1.2.2 單凝聚法正交試驗(yàn) 經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)及單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析，選定對(duì)制備伊維菌素微膠囊影響較顯著的因素:明膠濃度、囊芯比、介質(zhì)pH值和成囊溫度4個(gè)因素，以包封率為考察指標(biāo)，按L9(43)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)。正交設(shè)計(jì)因素和水平見(jiàn)表1。

表1 單凝聚法優(yōu)化正交設(shè)計(jì)因素水平表

1.2.3 微膠囊的形態(tài)觀察和粒徑的測(cè)定 取適量伊維菌素微囊溶液滴于250 μm格寬的細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，在400倍顯微鏡下進(jìn)行觀察，隨機(jī)選取10個(gè)視野，每個(gè)視野中的微囊不少于50粒，觀察其外觀形態(tài)，包括微球分散性、表面光滑度等。并采用Coolview軟件進(jìn)行粒徑統(tǒng)計(jì)和正圓度分析，估算其平均粒徑大小范圍。

1.2.4 微囊中伊維菌素含量的測(cè)定［9］標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:稱(chēng)取伊維菌素對(duì)照品10 mg，置于100 mL容量瓶中，用甲醇定容配置100 μg/mL的儲(chǔ)備液，分別用無(wú)水甲醇溶液稀釋成 2、4、6、8、10、20、40、60 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在242 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A242，進(jìn)行線性回歸。

方法精密度的測(cè)定:配制伊維菌素低、中、高濃度為4、10、40 μg/mL的伊維菌素對(duì)照品甲醇溶液三組，分別在 0、2、4、6、8 h 時(shí)刻處測(cè)定其 A242。

加樣回收率的測(cè)定:向空白微膠囊溶出液中分別加入低、中、高濃度為 4、10、40 μg/mL 的伊維菌素對(duì)照品甲醇溶液，檢測(cè)A242，計(jì)算回收率?；厥章?實(shí)測(cè)藥物含量/實(shí)際投藥量×100%

微囊中IVM含量測(cè)定:精密稱(chēng)取40 mg微囊，加入無(wú)水甲醇，置于超聲波細(xì)胞破碎機(jī)中，冰浴，電壓條件為500 V，超聲時(shí)間3 s，間隙時(shí)間4 s，工作次數(shù)為100次，按分光光度法測(cè)定吸光度A242。包封率(encapsulation efficiency，EE)的測(cè)定:包封率(EE%)=［微囊中伊維菌素含量/(微囊中伊維菌素的含量+介質(zhì)中伊維菌素含量)］×100%。

1.2.5 伊維菌素微膠囊表征及穩(wěn)定性考察 干燥失重:按照《中國(guó)藥典》2010年版二部附錄ⅧL測(cè)定。

紅外光譜分析:分別測(cè)定伊維菌素對(duì)照品、空白明膠微囊以及伊維菌素微囊紅外的譜圖進(jìn)行對(duì)比。

穩(wěn)定性研究:包括60℃高溫加速試驗(yàn)，75.0%高濕試驗(yàn)，測(cè)定主藥含量變化。

1.2.6 伊維菌素的體外動(dòng)態(tài)釋藥［10］取適量的伊維菌素市售制劑及等藥量伊維菌素微囊制劑，分別裝于透析袋中，采用中國(guó)藥典2010版溶出度第二法，溶出介質(zhì)為1%十二烷基硫酸鈉溶液(SDS)，溫度為(37±0.5)℃，轉(zhuǎn)速100 r/min，定時(shí)取樣10 mL，同時(shí)補(bǔ)充等量的新鮮介質(zhì)。根據(jù)各時(shí)間點(diǎn)累積的釋藥百分率，繪制伊維菌素市售制劑及伊維菌素微囊制劑的體外累積釋藥曲線。伊維菌素累積釋放率:P=Qn/Q0×100%，式中Qn為第n次取樣時(shí)伊維菌素的量Q0為初始伊維菌素的量。

2 結(jié)果與討論

2.1 單凝聚法制備最優(yōu)條件及其影響因素 單凝聚法微囊正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 伊維菌素微囊L9(43)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表2分析表明A3B2C1D3為最佳制備條件，即明膠濃度為5%、囊芯比為2∶1、介質(zhì)pH值為3.0～3.5、反應(yīng)溫度55℃時(shí)所制備的IVM微囊藥物包封率最高，鏡檢所制得微囊為球狀物，粒徑分布較為均勻，表面光滑，平均粒徑約為50 μm。

2.2 伊維菌素微膠囊的含藥量和包封率 按1.2.4伊維菌素含量測(cè)定方法求得線性回歸方程為A=0.0305C+0.0139(R2=0.9992);線性范圍為4.0 ～60.0 μg/mL?；厥章蕿?98.2%(n=5)，RSD為0.6%。測(cè)得最優(yōu)處方伊維菌素微膠囊的平均載藥量為18.3%，包封率為63.2%。

2.3 伊維菌素微膠囊表征及穩(wěn)定性考察結(jié)果

2.3.1 分別稱(chēng)取不同批次的伊維菌素微囊2.53 g和2.60 g，測(cè)得微膠囊的含水量為1.26% ～1.47%之間，符合2010版藥典規(guī)定。

2.3.2 伊維菌素微囊的紅外圖譜見(jiàn)圖1-圖3。

經(jīng)紅外光譜圖分析可知最優(yōu)處方其包被較為完全，伊維菌素結(jié)構(gòu)無(wú)變化。

2.3.3 微囊加速穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果如表3。

表3 伊維菌素微囊含量變化表

由上表可知，光照條件對(duì)微囊載藥量影響不大，相對(duì)來(lái)說(shuō)溫度和濕度是對(duì)微囊穩(wěn)定性有較顯著的影響，微囊制劑應(yīng)在干燥、陰涼處保存。

2.4 伊維菌素微膠囊體外釋藥的研究結(jié)果 伊維菌素為水溶性較差的藥物，為滿(mǎn)足漏槽所需條件的要求，分別選擇了0.5%、1.0%兩種濃度的SDS作為溶出介質(zhì)進(jìn)行相應(yīng)的藥物溶解度測(cè)定。根據(jù)測(cè)定結(jié)果，最終選擇1.0%SDS水溶液為釋放介質(zhì)。

在1.0%SDS 釋放介質(zhì)中，采用 1.2.4 所述方法進(jìn)行藥物體外釋放實(shí)驗(yàn)，伊維菌素微囊和伊維菌素市售制劑在釋放介質(zhì)中的伊維菌素累計(jì)釋放率見(jiàn)如圖4。

圖4 體外平均累計(jì)釋放曲線

可以看出，市售伊維菌素制劑75 h后，藥物累積釋放量達(dá)到93.3%。而實(shí)驗(yàn)室自制伊維菌素微囊18 h時(shí)釋放量為30.0%，44 h后藥物釋放量達(dá)到51.0%，而在75 h累積釋放量為60.1%，之后藥物呈緩慢持續(xù)釋放，所制微囊緩釋效果明顯。利用常用模型擬合探討微囊的釋藥機(jī)制，對(duì)固化伊維菌素微囊的累積釋藥曲線進(jìn)行擬合?？芍袒辆S菌素微囊體外藥物釋放最符合擴(kuò)散-溶蝕(Q=k0t1/2+k1t+k2t2+k3t3)數(shù)學(xué)模型。

采用單凝聚法制備伊維菌素微膠囊，影響成囊的因素較多，如明膠濃度，藥物的含量，囊芯比，攪拌速度，成囊溫度以及反應(yīng)體系的pH值和固化時(shí)間等。在本實(shí)驗(yàn)中采用5%的明膠為囊材，囊芯比為1∶2，pH 為3.0～3.5左右時(shí)易成較為滿(mǎn)意的微膠囊，凝聚后用10%的Na2SO4稀溶液進(jìn)行洗滌。既保證了微囊的較高產(chǎn)率和良好的微囊形狀，又可避免微囊的粘連，我們認(rèn)為合適的攪拌速率是提高包封率的關(guān)鍵。本文采用單凝聚法和復(fù)凝聚法分別制備了緩慢釋放的伊維菌素微膠囊，并對(duì)其進(jìn)行了穩(wěn)定性和體外釋放度的研究，旨在提高其生物利用度，降低其毒副作用，制備長(zhǎng)效緩釋的新型伊維菌素制劑。

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