郝利華，楊秀玉，宋 洋

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081;2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，山東青島 266000)

復(fù)方阿莫西林乳房注入劑是“十一五”國家科技支撐計劃項目研制的新制劑。由阿莫西林、舒巴坦、潑尼松龍與礦物油制成的供乳房灌注用滅菌混懸油溶液，用于奶牛乳房炎的治療。阿莫西林通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成而起抗菌作用［1］，獸醫(yī)臨床上常用于金黃色葡萄球菌、鏈球菌等革蘭陽性菌和大腸桿菌、巴氏桿菌等革蘭陰性菌引起的感染。舒巴坦是青霉烷砜類β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，與β-內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)合應(yīng)用后可產(chǎn)生明顯的增效作用，提高后者的抗菌活性，又?jǐn)U大了抗菌譜［2-3］。處方中添加糖皮質(zhì)激素類藥物潑尼松龍，以增加機(jī)體對炎癥的耐受性以及降低炎癥的血管反應(yīng)與細(xì)胞反應(yīng)，減少炎癥后遺癥。為了保證藥品的質(zhì)量和用藥安全，必須進(jìn)行無菌控制。本文根據(jù)《中國獸藥典》2010 年版一部附錄［4］、檢驗操作規(guī)程［5］對復(fù)方阿莫西林乳房注入劑的無菌檢查進(jìn)行了實驗研究，建立了可靠的無菌檢查方法并進(jìn)行了驗證。

1 材料與試藥

1.1 供試品 復(fù)方阿莫西林乳房注入劑(規(guī)格：12 g/支，含阿莫西林三水合物 0.8 g，批號 20090401、20090402、20090403，生產(chǎn)廠家：成都中牧生物藥業(yè)有限公司)。

1.2 青霉素酶 來源：中國藥品生物制品檢定所(批號20100105;規(guī)格：每1 mL大于300萬單位)。

1.3 培養(yǎng)基及沖洗液 培養(yǎng)基：硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。沖洗液：0.1%聚乙二醇或1%吐溫-80的0.1%中性酪蛋白胨滅菌溶液(酪蛋白胨1 g，加蒸餾水1000 mL，加熱溶解，調(diào)pH值為7.6，過濾，分裝滅菌)。以上培養(yǎng)基均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供，培養(yǎng)基均經(jīng)過無菌性檢查和靈敏度檢查合格。

1.4 驗證實驗用菌種(第三代) (1)金黃色葡萄球菌(Staphylococcus)［CMCC(B)26003］;(2)銅綠假單孢菌(Pseudomonas aeruginosa)［CMCC(B)10104］;(3)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)［CMCC(B)63501］;(4)生孢梭菌(Clostridium sporogenes)［CMCC(B)64941］;(5)白色念珠菌(Candida albicans)［CMCC(F)98001］(均為中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所保存)。

1.5 儀器 杭州高得泰林HTY-2000A無菌檢查儀(杭州高得泰林生物設(shè)備有限公司)，北京牛?；蛴邢薰救忾]式無菌濾器。

2 方法

2.1 菌液制備［4］(1)分別取金黃色葡萄球菌、銅綠假單孢菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯，于35℃培養(yǎng)18～24 h，用無菌0.9%氯化鈉溶液制成每1 mL含菌數(shù)小于100 CFU的菌懸液備用。(2)取生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基中，于35℃培養(yǎng)18～24 h，用無菌0.9%氯化鈉溶液制成每1 mL含菌數(shù)小于100 CFU備用。(3)取白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，于25℃培養(yǎng)24～48 h，用無菌0.9%氯化鈉溶液制成每1 mL含菌數(shù)小于100 CFU備用。

2.2 菌液計數(shù) 取上述5種菌液，金黃色葡萄球菌、銅綠假單孢菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各1 mL用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基35℃培養(yǎng)24～48 h;白色念珠菌1 mL用改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基25℃培養(yǎng)48～72 h，每種菌液接種2個平皿。計數(shù)，取平均值。活菌計數(shù)結(jié)果見表1。

2.3 培養(yǎng)基的靈敏度和無菌檢查 取裝量12 mL的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基10管，分別接種金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單孢菌、生孢梭菌各2管，每管接菌量為1 mL(含10～100 CFU/mL)，余下2管作為空白對照。取裝量9 mL的改良馬丁培養(yǎng)基4管，接種白色念珠菌2管，每管接菌量為1 mL(含10～100CFU/mL)，余下2管做空白對照，置規(guī)定的溫度培養(yǎng)5 d，逐日記錄培養(yǎng)結(jié)果。

表1 活菌計數(shù)結(jié)果表 CFU/mL

2.4 薄膜過濾法［4］取本品10支，傾倒出全部內(nèi)容物，混勻，取10 g，加入300 mL含0.1%聚乙二醇或1%吐溫-80的0.1%中性酪蛋白胨滅菌溶液，振搖使充分混勻，置無菌濾器內(nèi)，抽干，用上述滅菌溶液沖洗濾膜3次，每次100 mL，在最后一次的沖洗液中加入小于100 CFU/mL的金黃色葡萄球菌，照薄膜過濾法［4］檢查。

2.5 直接加入法［4］

2.5.1 青霉素酶滅活劑量確定 取供試品10支，擠出內(nèi)容物于無菌容器中，混勻，取供試品10 g，加稀釋液200 mL，充分振搖使分散。取上述溶液20 mL于5支滅菌試管中，分別以每1 mg阿莫西林加36000單位、18000單位、9000單位、6000單位和3000單位的青霉素酶，于37℃放置30 min，作為供試液。取上述供試液各3 mL于45 mL硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基中，加小于100 CFU的金黃色葡萄球菌，于30～35℃培養(yǎng)24 h。

2.5.2 青霉素酶作用時間確定 青霉素酶滅活時間分別為20、30、45 min，其余步驟同2.5.1 項。

2.5.3 所用稀釋液的量 方法同2.5.1項，稀釋液用量分別為 300、200、100 mL。

2.5.4 培養(yǎng)基用量確定 按2.5.1項處理后的樣品分別加入15、45、100、300 mL硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基中，加入規(guī)定量的金黃色葡萄球菌，按規(guī)定培養(yǎng)。

2.5.5 無菌驗證［4-6］取本品10支，傾倒出全部內(nèi)容物，混勻，取10 g，加入200 mL含0.1%聚乙二醇或1%吐溫-80的0.1%中性酪蛋白胨滅菌溶液，充分振搖使分散均勻，加青霉素酶600萬單位(每1 mg阿莫西林加青霉素酶9000單位)，37℃孵育30 min。取8支45 mL的硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基，分別接種小于100 CFU的金黃色葡萄球菌、銅綠假單孢菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各2支，一支加入酶作用后的供試液3 mL，另一支作為陽性對照;2支45 mL改良馬丁液體培養(yǎng)基，分別接種小于100 CFU的白色念珠菌，其中一支加入酶作用后的供試液3 mL，另一支為陽性對照。另取同批號的硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基及改良馬丁液體培養(yǎng)基，作為陰性對照組，置規(guī)定的溫度培養(yǎng)3～5 d。重復(fù)無菌驗證試驗2次。

2.6 供試品無菌檢查 取三批供試品，按照驗證過的無菌檢驗方法進(jìn)行檢查。

3 結(jié)果

3.1 培養(yǎng)基靈敏度及無菌檢查 結(jié)果如表2所示。

表2 培養(yǎng)基的靈敏度和無菌檢查

3.2 薄膜過濾法 采用杭州高得泰林有限公司的無菌集菌器，供試液不能全部通過濾膜;更換沖洗液，效果未改變。采用北京牛?；蛴邢薰緸V器過濾，能夠使藥物和沖洗液通過濾器，但過濾時間長，試驗中有崩膜現(xiàn)象發(fā)生。

3.3 直接加入法

3.3.1 青霉素酶滅活劑量的確定 以阿莫西林量計算，每1 mg阿莫西林加6000單位及以上青霉素酶，可將供試品滅活，結(jié)合無菌驗證最終選用每1 mg阿莫西林加9000單位青霉素酶滅活。

3.3.2 青霉素酶作用時間 青霉素酶作用20、30、45 min均可將供試品滅活，為保證作用時間，又不會使試驗時間太長，青霉素酶作用時間選用30 min。

3.3.3 所用稀釋液的量 以三個劑量的稀釋液稀釋樣品，發(fā)現(xiàn)供試品加入100 mL稀釋液中，油滴掛壁嚴(yán)重，影響試驗菌生長觀察，為使供試品充分分散，故選用200 mL劑量進(jìn)行稀釋。

3.3.4 培養(yǎng)基用量 培養(yǎng)基用量為15 mL時，培養(yǎng)24 h后供試液組生孢梭菌與枯草芽孢桿菌管較對照管菌液生長緩慢，而45 mL以上時，各菌兩管生長無差別。

3.3.5 無菌驗證 結(jié)果見表3。上述驗證菌株在此實驗條件下均能生長，證明了方法的有效性。具體實驗中可選擇金黃色葡萄球菌作為陽性菌株。

3.4 供試品無菌檢查 供試品陽性對照管24 h后觀察菌液生長良好，供試品管和陰性對照管14 d內(nèi)均無菌生長。

4 討論

4.1 分別按《中國獸藥典》規(guī)定的兩種無菌檢查法對復(fù)方阿莫西林乳房注入劑進(jìn)行了無菌方法研究。由于乳房注入劑劑型及工藝特點(diǎn)，供試品較黏稠，采用薄膜過濾法時不能使濾液完全通過濾膜，操作無法進(jìn)行;對不同廠家無菌集菌器進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)過濾困難并有崩膜現(xiàn)象發(fā)生，故無法采用薄膜過濾法。試驗最終選用直接加入法，并確定了青霉素酶的滅活劑量，建立了直接加入的無菌檢查方法，并進(jìn)行了方法學(xué)驗證，本文確立的無菌檢查方法可用于該藥物的無菌檢查。

4.2 具有抑菌活性的供試品無菌檢查，可根據(jù)《中國獸藥典》二〇一〇年版一部附錄加入中和劑或滅活劑消除供試品的抑菌活性。本研究采用青霉素酶消除供試品的抑菌成分，并通過增加培養(yǎng)基用量消除了供試品對敏感菌的抑菌活性。

4.3 考慮到本實驗室無生物安全柜，而黑曲霉對試驗環(huán)境影響較大，且黑曲霉非本品的敏感菌，認(rèn)為不做黑曲霉的無菌驗證對試驗結(jié)果無影響，故未進(jìn)行黑曲霉的無菌驗證試驗。

［1］沈建忠，謝聯(lián)金.獸醫(yī)藥理學(xué)［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2000.

［2］Williams J D.β -Lactamases and β -Lactamase inhibitors［J］.International journal of antimicrobial agents，1999，12(suppl 1)：S3-S7.

［3］丁宏斌，李建成，劉金鳳，等.半合成青霉素與β-內(nèi)酰胺酶抑制劑對奶牛乳房炎致病菌體外聯(lián)合藥敏的研究［J］.中國獸醫(yī)雜志，2009，45(8)：87-89.

［4］中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典二〇一〇年版一部［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2011：附錄137.

［5］中國藥品生物制品檢定所.中國藥品檢驗標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2005：313-323.

［6］蘇德模.微生物學(xué)檢驗手冊［M］.北京：科學(xué)出版社，2000：197.