王西麗，陳巧燕，李金峰，李 穎，薛 峰，蔣 原，朱 海

(1.深圳市易瑞生物技術(shù)有限公司，廣東深圳 518102;2.深圳市晨光乳業(yè)有限公司，廣東深圳 518107;3.江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測中心，南京 210001)

獸藥對(duì)于治療和預(yù)防動(dòng)物疾病發(fā)揮著積極的作用，為促進(jìn)動(dòng)物生長、保證動(dòng)物的規(guī)?；B(yǎng)殖和加工創(chuàng)造了條件。但獸藥的濫用或非法使用造成的殘留，對(duì)人類具有明顯的急、慢性毒性，如致癌、致敏、遺傳毒性(致胎兒畸形)、體內(nèi)蓄積、免疫抑制與耐藥性等。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，氯霉素是一種被廣泛使用的廣譜抗菌藥，曾廣泛用于治療各種敏感菌感染，然而由氯霉素殘留引起的嚴(yán)重危害越來越受到人們的重視。例如對(duì)造血系統(tǒng)有嚴(yán)重不良反應(yīng)，故對(duì)其臨床應(yīng)用現(xiàn)已做出嚴(yán)格控制。氯霉素用于食用動(dòng)物飼養(yǎng)和治療被中國及其他許多國家所嚴(yán)格禁止。

藥物殘留分析因具有待測藥物濃度低且波動(dòng)范圍大、樣品基質(zhì)復(fù)雜、干擾物質(zhì)多、樣品基質(zhì)和待測組分的不確定性等特點(diǎn)，傳統(tǒng)意義上的化學(xué)分析方法通常不能獨(dú)立進(jìn)行［1］。樣品前處理一般分為提取、凈化、濃縮和衍生化4個(gè)部分［1］。樣品前處理的好壞直接影響到分析的各項(xiàng)指標(biāo)、成本和效率［2］。

固相萃取(Solid Phase Extraction，SPE)是利用固體吸附劑將液體樣品中的目標(biāo)化合物吸附，與樣品的基體和干擾化合物分離，然后再用洗脫液洗脫達(dá)到分離和富集目標(biāo)化合物的目的。與液-液萃取相比，固相萃取不需大量互不相溶的溶劑，處理過程中不會(huì)出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，它采用高效、高選擇性的吸附劑，可以凈化很小體積的樣品，能顯著減少溶劑的用量，簡化樣品處理過程，同時(shí)降低成本。目前，納米材料(特別是磁性納米材料)因具有大的比表面積、可以有效提高回收效率［3-4］，使之在藥殘檢測的樣品前處理應(yīng)用中越來越受到關(guān)注［3-4］。磁性納米顆粒已經(jīng)廣泛應(yīng)用于核酸純化［5］、蛋白分離［6］、小分子檢測［4，7-8］等領(lǐng)域。本研究合成表面經(jīng)C18修飾的具有超順磁性的雙功能納米顆粒，以氯霉素作為提取對(duì)象，建立了一種利用C18-磁珠萃取樣品中氯霉素殘留的方法，并進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)。

1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器

甲醇(HPLC級(jí))、乙酸乙酯(HPLC級(jí))均為Fisher公司產(chǎn)品，甲酸(HPLC級(jí))為Tedia公司產(chǎn)品，正己烷(HPLC級(jí))為 Dikma公司產(chǎn)品，氨水(25% ～28%)、氯化鐵(AR級(jí))、氯化亞鐵(AR級(jí))、甲苯(AR級(jí))、氯化鈉(AR級(jí))為廣州化學(xué)試劑廠產(chǎn)品，二甲基十八烷基氯硅烷(AR級(jí))為Alfa Aesar公司產(chǎn)品，氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司，無水硫酸鈉(AR級(jí))為北京化工廠產(chǎn)品。

超高效液相色譜儀(ACQUITY RTMUltra Performance LC)、質(zhì)譜儀(Quattro Premier XE MSMS)、ACQUITY UPLCTM BEH C18色譜柱(100 mm × 2.1 mm，1.7 μm) 均為 Waters 公司產(chǎn)品，0.45μm濾器(有機(jī)相)為上海邁博瑞生物膜技術(shù)有限公司產(chǎn)品，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀為IKA公司產(chǎn)品，Milli Q純水儀為密理博公司產(chǎn)品。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 Fe3O4超順磁性納米顆粒的制備 稱取27.1 g FeCl3·6H2O和11.78 g FeCl2·4H2O于500 mL去離子水中溶解。高速攪拌下，加入37 mL氨水，繼續(xù)高速攪拌30 min;磁力吸附，去除上層液體;用2 L水洗滌顆粒三次;將該顆粒定容至500 mL。

2.2 Fe3O4@SiO2超順磁性顆粒的制備 將上述所得Fe3O4顆粒超聲15 min，邊攪拌邊以0.5 mL/min的速度加入84 mL硅酸鈉，隨后以1 mL/min的速度逐滴加入1 mol/L鹽酸135 mL;磁力吸附，去除上層液體;用2 L水洗滌顆粒5次;將磁珠置于60℃真空干燥箱中干燥24 h。

2.3 磁珠的表面修飾［4］取上述顆粒0.05 g，超聲分散于20 g甲苯中，隨后加入0.5 g二甲基十八烷基氯硅烷、0.5 g吡啶，室溫下機(jī)械攪拌10 h。磁吸附，分別用乙醇和水洗滌顆粒若干次。將磁珠置于60℃真空干燥箱中干燥24 h。將磁珠重懸于10%的甲醇中，制成10 mg/mL的懸液，4℃保存，備用。

2.4 獸藥殘留磁珠提取方法的建立

2.4.1 結(jié)合溫度及時(shí)間的優(yōu)化 將120 μL磁珠添加到1 mL氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 μg/mL)中，渦旋混勻，置于旋轉(zhuǎn)混合儀上，分別于30℃、40℃、50℃條件下，結(jié)合 1、2、3、4、5 min;磁力吸附，去除上清;加入1 mL超純水，渦旋混勻，去除上清，重復(fù)本步操作一次;加入1 mL甲醇，渦旋混勻，磁力吸附，取上清于潔凈離心管中，重復(fù)本操作兩次，合并上清;用0.22 μm濾膜過濾，收集濾液2 mL，加入2 mL水，混勻，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定(參照SN/T 1864-2007進(jìn)行)。

2.4.2 磁珠用量優(yōu)化 將 60、80、100、120、140、160 μL磁珠添加到1 mL氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 μg/mL)中，渦旋混勻，置于旋轉(zhuǎn)混合儀上，置于50℃結(jié)合5 min;磁力吸附，去除上清;加入1 mL超純水，渦旋混勻，去除上清，重復(fù)本步操作一次;加入1 mL甲醇，渦旋混勻，磁力吸附，取上清于潔凈離心管中，重復(fù)本操作兩次，合并上清;用0.22 μm濾膜過濾，收集濾液2 mL，加入2 mL水，混勻，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定(參照SN/T 1864-2007進(jìn)行)。

2.4.3 線性范圍及檢出限的確定 參照標(biāo)準(zhǔn)方法，添加不同量的氯霉素到空白蝦肉樣品中，用磁珠法回收，每個(gè)濃度重復(fù)回收5次，取其平均值，以峰面積為縱坐標(biāo)、加標(biāo)樣品濃度為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體方法如下：①制樣、提?。簠⒄?SN/T 1864-2007進(jìn)行。②凈化：將100 μL磁珠添加到上述所得的4 mL水溶液中，渦旋混勻，置于旋轉(zhuǎn)混合儀上，置于50℃結(jié)合5 min;磁力吸附，去除上清;加入1 mL超純水，渦旋混勻，去除上清，重復(fù)本步操作一次;加入1 mL甲醇，渦旋混勻，磁力吸附，取上清于潔凈離心管中，重復(fù)本操作兩次，合并上清;收集濾液，加入等體積水，混勻，用0.45 μm 濾膜過濾，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。③檢測：參照SN/T 1864-2007進(jìn)行。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 對(duì)添加不同量氯霉素的空白樣品進(jìn)行重復(fù)提取，重復(fù)提取5次(參照2.4.3項(xiàng)進(jìn)行)，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。

2.6 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn) 添加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液至空白樣品中進(jìn)行提取，并用磁珠法和標(biāo)準(zhǔn)法重復(fù)回收3次(參照2.4.3項(xiàng)進(jìn)行)，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

3 結(jié)果

3.1 表征 圖1為C18鍵合磁珠的透射電鏡照片，由圖1可以看出，顆粒近似球形，粒徑大小約為300 nm。圖2為C18鍵合磁珠在磁場作用下和不在磁場作用下圖片。

圖1 C18修飾磁珠掃描電鏡照片

3.2 獸藥殘留磁珠前處理方法的建立

3.2.1 磁珠結(jié)合時(shí)間與結(jié)合溫度的優(yōu)化 圖3為用磁珠法回收氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品柱狀圖，從圖中可以看出，隨著溫度的升高，回收率越來越高，隨著結(jié)合時(shí)間的延長，回收率也越來越高。50℃結(jié)合5 min時(shí)，基本達(dá)到飽和狀態(tài)。因而，將磁珠的結(jié)合時(shí)間定為5 min，結(jié)合溫度定為50℃。

3.2.2 磁珠用量優(yōu)化 往1 mL 10 μg/mL的氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品中添加 60、80、100、120、140、160 μL 磁珠，圖4為回收效果圖。從圖中可以看出，隨著磁珠量的增加，回收率也在增加，當(dāng)磁珠的量達(dá)到120 μL以后，回收率不再增加，因此，將磁珠的添加量定為 120 μL。

圖4 磁珠用量優(yōu)化

3.3 線性范圍及檢出限的確定 參照標(biāo)準(zhǔn)方法，添加不同量的氯霉素到空白蝦肉樣品中，用磁珠法回收，每個(gè)濃度重復(fù)回收5次。圖5為氯霉素回收標(biāo)準(zhǔn)曲線，方法的線性范圍0.1～10 μg/kg，標(biāo)準(zhǔn)曲線是 y=13707x+5530.8，R2=0.9941，以信噪比S/N=3為檢出限，本方法的最低檢出限為0.1 μg/kg。

圖5 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.4 精密度實(shí)驗(yàn) 對(duì)添加不同量氯霉素的空白樣品進(jìn)行重復(fù)提取，重復(fù)提取5次，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。0.1 μg/kg加標(biāo)樣品的RSD 為5.7%;0.2 μg/kg加標(biāo)樣品的 RSD為6.3%;0.5 μg/kg 加標(biāo)樣品的 RSD 為4.8%。

3.5 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn) 往空白蝦肉中添加不同量的氯霉素，分別用標(biāo)準(zhǔn)法和磁珠法進(jìn)行回收，每個(gè)濃度重復(fù)提取3次，計(jì)算平均回收率。結(jié)果見表1。從表中可以看出兩種方法的回收率基本一致，整體上看，標(biāo)準(zhǔn)法的回收率略高于磁珠法。

表1 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn) %

4 討論

4.1 超順磁性納米顆粒的合成 目前，用于制備超順磁性納米顆粒的材料有很多種，如Fe3O4、γ-Fe2O3、MeFe2O4(Me=Co、Mn、Ni)、金屬 Ni、Co、Fe等，其中，又以Fe3O4應(yīng)用最為廣泛。本研究中，三價(jià)鐵和二價(jià)鐵在堿性條件下共沉淀，獲得了具有超順磁性的納米顆粒，并在其表面包裹一層二氧化硅。二氧化硅層的形成對(duì)超順磁性的納米顆粒有著極其重要的意義［4］：①二氧化硅層有效防止了納米Fe3O4顆粒之間的聚集;②二氧化硅表面存在著豐富的硅醇基，易于被活化，從而易于在顆粒的表面引入各種功能基團(tuán);③二氧化硅是一種惰性材料，不易與其他物質(zhì)反應(yīng)。硅烷偶聯(lián)劑因其易于與二氧化硅表面的硅醇基反應(yīng)，因而在各個(gè)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。本研究將二甲基十八烷基氯硅烷與顆粒表面的硅醇基反應(yīng)，從而在顆粒表面引入了十八烷基，獲得了一種高效的雙功能納米顆粒。

4.2 獸藥殘留磁珠法提取方法的建立 本研究以氯霉素為研究對(duì)象，建立了一種以C18鍵合磁珠萃取蝦肉中氯霉素的方法，代替標(biāo)準(zhǔn)方法中的C18柱固相萃取法，操作簡單，更有利于待測樣品的大批量、自動(dòng)化前處理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，磁珠法回收氯霉素的線性范圍 0.1 ～ 10 μg/kg，標(biāo)準(zhǔn)曲線是y=13707x+5530.8，R2=0.9941，以信噪比 S/N=3為檢出限，最低檢出限為0.1 μg/kg，完全能夠滿足檢測需要。

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