姚 敏 陳 劍 王文娟 張曉玲 楊筱曦 周 清 徐錦堂

角膜是眼主要的屈光介質(zhì)，角膜病，尤其是位于中央角膜的病灶，嚴(yán)重影響視力。角膜上皮作為角膜的第一道屏障，易受外傷、炎癥的損傷，一旦遭受角膜緣、大面積或累及上皮基底細(xì)胞的損傷，上皮難以再生修復(fù)保持完整，角膜將失去透明性。

角膜移植術(shù)是目前角膜盲最為有效的治療手段，但因供體的匱乏及免疫排斥反應(yīng)，研究尋找有效的替代物顯得尤為迫切。組織工程領(lǐng)域已有大量研究表明:人羊膜上皮細(xì)胞(human amniotic epithelial cells，hAEC)具有胚胎干細(xì)胞特性，擁有多能分化潛能，且具有免疫赦免性，是未來組織工程領(lǐng)域理想的種子細(xì)胞[1-3]。本實驗旨在探索利用人永生化角膜上皮細(xì)胞(immortalized human corneal epithelial cells，ihCEC)培養(yǎng)液模擬角膜上皮細(xì)胞微環(huán)境，誘導(dǎo)hAEC分化為角膜上皮樣細(xì)胞的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 HIV、甲肝、乙肝、衣原體、梅毒等血清學(xué)檢查均為陰性，(37±1)周妊娠產(chǎn)婦剖宮產(chǎn)羊膜，取自暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院。產(chǎn)婦知情同意，本實驗經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)同意。ihCEC株由中山大學(xué)眼科中心王智崇教授饋贈。

1.2 主要試劑和儀器 DMEM干粉(Gibco公司，美國)，胎牛血清(FBS，杭州四季青公司)，膠原酶Ⅱ、Dnase(Sigma公司，美國)，胰蛋白酶干粉(Hyclone公司，美國)，乙二胺四乙酸二鈉(EDTA;Sigma公司，美國)，羊抗人 CK12(Santa Cruz公司，美國)，驢抗羊IgG二抗異硫氰酸熒光素標(biāo)記(FITC，康為世紀(jì))，CCK8試劑盒(Dojindo公司，日本)，絲裂霉素(浙江海正藥業(yè));倒置相差顯微鏡、熒光顯微鏡(Leica公司，德國)，F(xiàn)AC-SCalibur流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson公司，美國)，酶標(biāo)儀(Safire2公司，瑞士)。

1.3 方法

1.3.1 hAEC的提取、原代及傳代培養(yǎng) 無菌條件下取剖宮產(chǎn)術(shù)中新鮮羊膜，浸泡于含400×103U·L-1慶大霉素的滅菌PBS中，超凈臺內(nèi)用含100×103U·L-1青霉素和100×103U·L-1鏈霉素的PBS漂洗，輕輕刮去血液、黏液及組織碎屑，漂洗干凈后將其剪成1 mm×1 mm大小;加入足量2 g·L-1膠原酶Ⅱ +0.05 g·L-1Dnase孵箱內(nèi)消化4 h，離心，倒去上清;加入適量 2.5 g·L-1胰酶 +0.2 g·L-1EDTA孵箱內(nèi)消化5 min，加入完全培養(yǎng)液終止消化，離心，吸去上清，加入含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，輕輕吹打，形成單細(xì)胞懸液，以109L-1密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置含體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)48 h全量換液，以后每2～3 d換液1次。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及生長狀態(tài)。待細(xì)胞達(dá)80%～90%融合時，以1∶1～2比例傳代。

1.3.2 流式細(xì)胞儀檢測hAEC表面抗原 將生長狀態(tài)良好的第2-3代hAEC消化后離心收集單細(xì)胞懸液，800 r·min-1離心5 min，PBS漂洗 2次，適當(dāng)稀釋，流式細(xì)胞儀檢測 CD29、CD90、CD105、CD34、HLA-DR。

1.3.3 ihCEC的復(fù)蘇及傳代培養(yǎng) -80℃取出凍存管，37℃水浴1 min迅速解凍，加入裝有8 mL含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中，輕輕吹打混勻，800 r·min-1離心 5 min，倒去上清，PBS 重懸，再次離心，棄去上清，加完全培養(yǎng)基培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，第2天換液。待細(xì)胞達(dá)80%融合時，以1∶3～5比例傳代。

1.3.4 不同濃度絲裂霉素對ihCEC增殖活性的影響 將ihCEC以每孔10×103接種于96孔板，實驗分5組，每組5個復(fù)孔，待貼壁后分別以0 mg·L-1、10 mg·L-1、20 mg·L-1、30 mg·L-1、40 mg·L-1絲裂霉素處理ihCEC 2 h，吸去絲裂霉素，每孔加200 μL含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)72 h，CCK8測吸光度，計算增殖抑制率。此后實驗組于隔天繼續(xù)測吸光度，觀察不同濃度絲裂霉素作用的穩(wěn)定性及持續(xù)時間。

1.3.5 絲裂霉素處理的 ihCEC細(xì)胞培養(yǎng)液對hAEC增殖活性的影響 待ihCEC接近70%融合時，以 10 mg·L-1、20 mg·L-1絲裂霉素作用 ihCEC 2 h后完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別培養(yǎng)12 h、24 h后收集各濃度組培養(yǎng)液，4℃保存?zhèn)溆谩Ｈ∩L狀態(tài)良好的hAEC以每孔3000個細(xì)胞接種于96孔板，實驗設(shè)5組，分別為A(對照組)、B(10 mg·L-1絲裂霉素培養(yǎng)12 h后培養(yǎng)液組)、C(10 mg·L-1絲裂霉素培養(yǎng)24 h后培養(yǎng)液組)、D(20 mg·L-1絲裂霉素培養(yǎng)12 h后培養(yǎng)液組)、E(20 mg·L-1絲裂霉素培養(yǎng)24 h后培養(yǎng)液組)，每組5個復(fù)孔，于培養(yǎng)后第1天、第3天、第5天、第7天、第9天CCK8法測各組吸光度，繪制生長曲線。

1.3.6 條件培養(yǎng)基的配制 待ihCEC接近70%融合時吸去培養(yǎng)液，20 mg·L-1絲裂霉素處理細(xì)胞2 h后換新鮮培養(yǎng)液，每12 h收集培養(yǎng)液，4℃保存，持續(xù)收集5 d，將收集的培養(yǎng)液1000 r·min-1離心3 min。上清以40 μm細(xì)胞濾器過濾，除去培養(yǎng)液中雜質(zhì)及細(xì)胞團或碎屑。過濾后的細(xì)胞培養(yǎng)液4℃保存1個月內(nèi)用完或-20℃保存3個月內(nèi)用完。使用時與完全培養(yǎng)基以1∶1比例混合，即為條件培養(yǎng)基(conditioned media，CM)。

1.3.7 誘導(dǎo)分化實驗及間接免疫熒光鑒定 取生長狀態(tài)良好的P2-3 hAEC，以100×103cm-2密度接種到放有載玻片的6孔板內(nèi)，待貼壁后換CM培養(yǎng)10 d，40 g·L-1多聚甲醛固定 15 min，3 g·L-1Triton-100破膜30 min，體積分?jǐn)?shù)5%驢血清封閉1 h，加CK12一抗4℃孵育過夜，洗去孵育液，加FITC熒光二抗，室溫孵育40 min，洗去孵育液，加DAPI核染，室溫孵育30 min，洗去孵育液，滴抗熒光淬滅劑封片，4℃冰箱避光保存，熒光顯微鏡下觀察拍照。以ihCEC為陽性對照，誘導(dǎo)前hAEC為陰性對照，操作步驟同上。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 SPSS 13.0軟件包分析處理，1.3.4 所得數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，1.3.5 所得數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hAEC和ihCEC形態(tài)觀察 hAEC原代培養(yǎng)細(xì)胞片狀生長，呈圓形、橢圓形、三角形，細(xì)胞邊界圓鈍，胞漿豐富，胞核飽滿，具有很強的立體感，細(xì)胞聚集處可見鋪路石樣外觀;其間夾雜少量羊膜間充質(zhì)細(xì)胞，傳代時，間充質(zhì)細(xì)胞短時間內(nèi)即可脫壁，根據(jù)這一特點，可在傳代過程中獲得純化的hAEC;hAEC原代培養(yǎng)生長緩慢，7～9 d可傳代;傳代培養(yǎng)后，細(xì)胞增殖較為活躍，可見有絲分裂后整齊排列的成對子代細(xì)胞(圖1A)。ihCEC大小均一，體積較小，初呈三角形、短梭形或不規(guī)則多邊形，待接近80%融合時，細(xì)胞形態(tài)一致，呈不規(guī)則多邊形;生長迅速，3 d即長滿呈鋪路石樣外觀;可復(fù)層，但最終因接觸抑制，細(xì)胞迅速凋亡(圖1B-C)。

Figure 1 Morphology of hAEC and ihCEC.A:Primary hAEC cultured for 5 days in vitro(×50);B:ihCEC recovered 24 hours(×50);C:ihCEC cultured for 3 dayshAEC和ihCEC形態(tài)觀察。A:原代hAEC體外培養(yǎng)5 d(×50);B:ihCEC復(fù)蘇24 h(×50);C:ihCEC培養(yǎng)3 d

2.2 hAEC流式細(xì)胞儀鑒定 hAEC可表達(dá)胚胎干細(xì)胞表面標(biāo)記分子:CD29(94.87%)、CD90(93.94%)、CD105(33.28%);不表達(dá) CD34(0.12%)、HLA-DR(0.10%)。表明 hAEC 具有干細(xì)胞特性可能，且無免疫原性(圖2)。

Figure 2 Detection of stem cell surface markers by flow cytometry showed the expression of CD29(94.87%)，CD90(93.94%)，CD105(33.28%)，CD34(0.12%)，HLA-DR(0.10%) 流式細(xì)胞儀分析 hAEC 表達(dá) CD29(94.87%)、CD90(93.94%)、CD105(33.28%)、CD34(0.12%)、HLA-DR(0.10%)

2.3 絲裂霉素對ihCEC增殖活性的影響 經(jīng)不同濃度絲裂霉素處理后，ihCEC增殖活性受到不同程度的抑制。處理后培養(yǎng)72 h，增殖抑制率分別為10 mg·L-1(65.48% ±1.03)、20 mg·L-1(77.01% ±0.99)、30 mg·L-1(75.25% ± 0.71)、40 mg·L-1(76.90% ±0.97);10 mg·L-1絲裂霉素增殖抑制作用最小(P＜0.05)，其他各組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)。隨著時間的延長，10 mg·L-1、30 mg·L-1、40 mg·L-1絲裂霉素組存活細(xì)胞大量減少，20 mg·L-1絲裂霉素組抑制作用相對穩(wěn)定(圖3)。

2.4 ihCEC細(xì)胞培養(yǎng)液對hAEC增殖活性的影響

B組、C組、D組、E組細(xì)胞培養(yǎng)液可促進(jìn)hAEC增殖(P＜0.05)，其中 D組促增殖作用最強(P＜0.05)，而E組培養(yǎng)5 d后明顯不利于hAEC的生長(P＜0.05)。促增殖各組于培養(yǎng)第3天進(jìn)入對數(shù)增長期，第7天后增殖速度減慢(圖4)。

Figure 3 Effects of different concentrations of mitomycin on proliferation activity of ihCEC 不同濃度絲裂霉素對ihCEC增殖活性的影響

2.5 誘導(dǎo)分化實驗及間接免疫熒光鑒定 誘導(dǎo)分化10 d，hAEC體積較誘導(dǎo)前變大，細(xì)胞邊緣銳利，界線明顯，呈不規(guī)則多邊形或三角形;細(xì)胞較誘導(dǎo)前變得扁平，細(xì)胞表面欠光滑(圖5)。間接免疫熒光檢測，誘導(dǎo)前hAEC不表達(dá)角膜上皮細(xì)胞特異性標(biāo)記物CK12，誘導(dǎo)10 d后hAEC可表達(dá)CK12(圖6)。

Figure 4 Effects of culture media collected from ihCEC on proliferation activity of hAEC ihCEC培養(yǎng)液對hAEC增殖活性的影響

Figure 5 Morphology of hAEC before and after differentiation(×50).A:Before differentiation;B:Differentiating of 10 days hAEC誘導(dǎo)前后的形態(tài)觀察(×50)。A:誘導(dǎo)前;B:誘導(dǎo)分化10 d

3 討論

羊膜位于胎盤最內(nèi)層，為一半透明薄層組織，含有兩種細(xì)胞成分:羊膜上皮細(xì)胞(AEC)、羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(AMSC)。AEC為緊密排列的單層立方細(xì)胞，系外胚層來源。Miki等[4-5]研究發(fā)現(xiàn):hAEC表達(dá)胚胎干細(xì)胞保持分化潛能的關(guān)鍵基因OCT-4和nanog，不表達(dá)端粒酶，無腫瘤源性。在不同生長因子和微環(huán)境調(diào)控下，hAEC可向三個胚層組織細(xì)胞分化[3，6]。hAEC 不表達(dá) HLA-A、-B、-C、-DR 和 β2 微球蛋白(β2 m)，具有免疫赦免性[7]。Li等[8]研究發(fā)現(xiàn):hAEC分泌可溶性炎癥抑制因子，調(diào)控固有免疫和適應(yīng)性免疫。羊膜來源廣泛且無道德倫理爭議。劉小勇等[9]研究表明:hAEC可向角膜上皮細(xì)胞分化。hAEC的以上特性說明其有望成為組織工程角膜的種子細(xì)胞。

Figure 6 Immunocytochemistry images of CK12 expression before and after differentiation.A:ihCEC expressed CK12(green);B:hAEC expressed no CK12 before differentiation;C:hAEC expressed CK12 after differentiating hAEC of 10 days(1:DAPI staining-blue;2:CK12-FITC staining-green;3:Merge)hAEC誘導(dǎo)前后CK12的免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色。A:ihCEC表達(dá)CK12(綠色);B:誘導(dǎo)前hAEC不表達(dá)CK12;C:hAEC誘導(dǎo)分化10 d后可表達(dá)CK12(1:DAPI核染:藍(lán)色;2:CK12-FITC染色:綠色;3:DAPI-FITC融合)

Jiang等[10]研究發(fā)現(xiàn):誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為角膜上皮樣細(xì)胞后再行移植治療鼠堿燒傷角膜緣干細(xì)胞缺乏(LSCD)模型，較未誘導(dǎo)組可明顯增加角膜透明度，減少角膜新生血管。由此可見探索向角膜上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的優(yōu)化條件具有一定研究價值。細(xì)胞所處的微環(huán)境決定了細(xì)胞增殖、分化及移行能力[11]。近年來大量研究表明:將具有多能分化潛能的種子細(xì)胞以目的細(xì)胞所處的微環(huán)境條件培養(yǎng)，可成功獲得陽性表達(dá)目的細(xì)胞特異性標(biāo)記物的轉(zhuǎn)分化細(xì)胞。國內(nèi)外研究者提取角膜上皮細(xì)胞[12]、角膜基質(zhì)細(xì)胞[10]、角膜緣成纖維細(xì)胞[13-14]，以收集培養(yǎng)液、非接觸共培養(yǎng)或混合培養(yǎng)的方式，模擬角膜上皮細(xì)胞微環(huán)境，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為角膜上皮樣細(xì)胞。雖然可成功誘導(dǎo)，但是由于人源性角膜組織難以獲得，實驗多采用動物角膜組織，如兔、鼠、豬、牛等，這就面臨著異種移植免疫排斥反應(yīng)的可能。即使得到人源性角膜組織，細(xì)胞提取和培養(yǎng)較為復(fù)雜、困難，耗時較長，花費高，且細(xì)胞不能無限增殖傳代。因此，為了避免以上缺陷，本實驗嘗試以ihCEC細(xì)胞培養(yǎng)液模擬角膜上皮細(xì)胞微環(huán)境，探索其在組織工程領(lǐng)域應(yīng)用的可行性。

ihCEC增殖迅速，可無限傳代，表達(dá)角膜上皮特異性細(xì)胞角蛋白[15]。目前ihCEC主要用于藥物研究領(lǐng)域，因其致瘤性可能及缺乏屏障功能，在組織工程領(lǐng)域研究應(yīng)用較少。本實驗所用的ihCEC系經(jīng)改善培養(yǎng)條件、通過連續(xù)傳代的方法獲得的永生化細(xì)胞株，未經(jīng)任何病毒轉(zhuǎn)染或基因逆轉(zhuǎn)錄，具有一定安全性[16]。參照 Ahmad 等[13]的實驗方法，先用不同濃度絲裂霉素處理ihCEC，抑制其迅速增殖能力，探索最佳濃度，以充分爭取時間大量收集細(xì)胞培養(yǎng)液。將不同濃度絲裂霉素處理ihCEC后于不同時間收集細(xì)胞培養(yǎng)液用以培養(yǎng)hAEC，CCK8法測hAEC生長曲線，結(jié)果表明20 mg·L-1絲裂霉素作用12 h收集的細(xì)胞培養(yǎng)液具有明顯的促增殖作用，說明此濃度此時間收集的細(xì)胞培養(yǎng)液含有大量促增殖的可溶性細(xì)胞因子;細(xì)胞培養(yǎng)液作用7 d后細(xì)胞增殖減慢，有進(jìn)入平臺增長期的趨勢，符合hAEC生長的一般規(guī)律。間接說明該法收集的細(xì)胞培養(yǎng)液無致瘤性。將收集的細(xì)胞培養(yǎng)液以等比例與完全培養(yǎng)基混合制成CM用于培養(yǎng)hAEC，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察及免疫細(xì)胞化學(xué)染色，hAEC可分化為角膜上皮樣細(xì)胞，說明CM中含有某些成分可以誘導(dǎo)多能干細(xì)胞定向朝角膜上皮樣細(xì)胞分化，但具體是哪些成分還需要進(jìn)一步深入研究。

本實驗為初步研究，僅對轉(zhuǎn)分化后hAEC進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察及CK12的檢測，不能說明hAEC完全分化為角膜上皮細(xì)胞，分化后是否具有角膜上皮細(xì)胞的功能亦需進(jìn)一步研究證實。

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