宗 哲 付 研 李大鵬 程 晉 王 磊 李建中 常 靜 張立克

血管介入是治療外周血管阻塞性疾病和心腦血管疾病的常用方法，但術(shù)后血管再狹窄（Restenosis，RS）是臨床應(yīng)用中的主要問題。由于術(shù)后RS的形成是多因素、多環(huán)節(jié)參與的復(fù)雜過程，因此調(diào)動機體內(nèi)源性抗RS的多種機制，對預(yù)防RS，尤其是術(shù)后遠(yuǎn)期RS非常重要。

近年來，細(xì)胞色素P450／環(huán)－二十碳三烯酸（Cytochrome P450／Epoxyeicosatrienoic Acids，CYP450／EETs）對血管的多環(huán)節(jié)作用引起人們的重視。人血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞中存在著CYP450的亞型2J2（CYP2J2），而大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞中存在的主要是2J3（CYP2J3），它們可催化花生四烯酸（Arachiodonic Acid，AA）生成11，12－環(huán)－二十碳三烯酸（11，12－Epoxyeicosatrienoic Acids，11，12－EET）等。

本文通過觀察CYP2J3基因轉(zhuǎn)染對實驗大鼠胸主動脈球囊損傷后RS的影響，分析CYP2J3／EET系統(tǒng)與血管損傷后RS的關(guān)系，為闡明血管損傷后RS的發(fā)生機制，以及基因療法在介入治療術(shù)后RS的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級雄性 Wistar大鼠36只，體重280～300g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心提供，動物質(zhì)量合格證號：SCXK－（軍），NO：0059020；Western blotting發(fā)光試劑盒、BCA（Bicinchoninic Acid）蛋白定量試劑盒（美國Pierce公司）；總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Promega公司）；Taq Platinum PCR MasterMix及無內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒（天根公司，中德合資）；DNA Marker及蛋白預(yù)染Marker（中國全式金公司）；無水乙腈（Anhydrous Acetonitrile）；96%甲酸（Formic Acid，美國 Sigma公司）；N，N－diisopropylethylamine（美國 Sigma公司）；固相萃取柱（Solid Phase Eextraction，SPE）（美國 Waters公司）；pcDNA3.1－CYP2J3質(zhì)粒由首都醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室實驗室構(gòu)建；余各試劑均為市售分析純產(chǎn)品；PCR引物由上海生工合成，內(nèi)參β－actin上下游引物分別為：5’－ACC TAT CCC TTC AGC AGT TTG TG－3’，5’－TGG TAG GCT TCC TCT TGT ATT CG－3’，擴增產(chǎn)物大小為450bp；CYP2J3上下游引物分別為5’－ACC TAT CCC TTC AGC ATT TGT G－3’，5’－TGG TAG GCT TCC TCT TGT ATT CG－3’，擴增產(chǎn)物大小為300bp。

1.2 重組pcDNA3.1－CYP2J3質(zhì)粒的提取和純化

將前期構(gòu)建成功的真核表達(dá)質(zhì)粒PcDNA3.1－CYP2J3，分別經(jīng)KpnI、NotI雙酶切鑒定后，用無內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑提取。紫外分光光度計（Eppendorf）檢測提取質(zhì)粒純度 A260／A280≈1.8，濃度約1g／L。

1.3 實驗分組及處理

大鼠飼養(yǎng)1周后，首先建立胸主動脈球囊損傷模型［2］（18只），于制模同時隨機分為三組（每組6只），分別從鼠尾靜脈注入生理鹽水（動脈損傷鹽水組）、CYP2J3重組質(zhì)粒組（動脈損傷2J3組）及pcDNA3.1（動脈損傷3.1組），3ml／kg體重；另選18只實驗大鼠亦隨機分為三個假手術(shù)組，除不進行胸主動脈球囊損傷外，其它處理同上三組，分別為假手術(shù)鹽水組、假手術(shù)2J3組和假手術(shù)3.1組，每組6只。術(shù)后第28天采用頸椎脫臼法處死各組大鼠，快速摘取胸主動脈，經(jīng)生理鹽水沖洗，剝離干凈血管周圍結(jié)締組織后分別用0.01%DEPC水沖洗3遍后，取0.5cm～1.0cm段置于10%中性福爾馬林中固定至少24h備用；取1.5cm～2.0cm段置于液氮或者深低溫冰箱備用。

1.4 胸主動脈相對管腔面積（Rrelative Luminal Area，RLA）測定

取中性福爾馬林固定24h的胸主動脈標(biāo)本，經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋、切片、HE染色后鏡下觀察。按照組織學(xué)劃分血管內(nèi)膜（內(nèi)彈力膜以內(nèi)）、血管中膜（內(nèi)、外彈力膜之間）和血管外膜（外彈力膜以外）。在4倍物鏡下將完整的血管橫切面HE染色圖像攝入計算機圖像分析系統(tǒng)中進行圖像編輯，用鼠標(biāo)準(zhǔn)確勾畫出外彈力膜、內(nèi)彈力膜以及管腔的輪廓，計算管腔面積（Lumenaera，LA），每張切片測3次，取平均值。以LA與內(nèi)膜、中膜和LA之和的比值為RLA。

1.5 胸主動脈CYP2J3mRNA表達(dá)水平測定

自液氮中取出胸主動脈標(biāo)本加入冷裂解液中，快速勻漿，經(jīng)氯仿和異丙醇抽提、75%乙醇漂洗，室溫干燥后得到RNA，加入DEPC水溶解。提取RNA作為PCR模板，采用RT－PCR法檢測細(xì)胞CYP2J3mRNA表達(dá)，以其吸光度值與β－actin吸光度值的比值表示。

1.6 胸主動脈11，12－EET 含量檢測

自液氮中取出胸主動脈標(biāo)本，11，12－EET檢測標(biāo)本制備：20mg組織置于200μl甲醇和0.4μl甲酸中低溫超聲勻漿，提取上清液進行衍生，產(chǎn)物經(jīng)氬氣吹干后溶解于30μl無水乙腈中，置于－80℃深低溫冰箱中保存。采用高效液相色譜法（High Pressure Liquid Chromatography，HPLC，安捷倫公司提供高效液相色譜分析系統(tǒng)）檢測其11，12－EET 含量［8］。標(biāo)準(zhǔn)品為11，12－EET，層析柱為 Agilent公司SBC18，流動相：A相為0.5%甲酸水溶液，B相為0.5%甲酸乙腈溶液，流速1ml／min，層析條件：前40min B相濃度由50%增至65%，其后80min B相濃度由65%增至100%，最后以B相100%維持20min。11，12－EET色譜峰值出現(xiàn)在第85min左右。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS13.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示。各組間計量資料的比較采用單因素方差分析（One Way ANOVA），差異顯著，則采用最小顯著差（Least Significant Difference，LSD）法進行兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組RLA

假手術(shù)組2J3基因轉(zhuǎn)染及單純PC3.1質(zhì)粒對動脈環(huán)RLA無明顯影響（P＞0.05），而胸主動脈損傷使RLA減?。≒＜0.05或P＜0.01）；但動脈損傷2J3組RLA明顯大于動脈損傷鹽水組及動脈損傷3.1組（P＜0.01），提示CYP2J3基因轉(zhuǎn)染可減輕動脈損傷后血管狹窄的程度（圖1）。

圖1 各組大鼠胸主動脈相對管腔面積比較（s，n均＝6）

2.2 各組CYP2J3mRNA表達(dá)

假手術(shù)2J3組CYP2J3mRNA表達(dá)高于假手術(shù)鹽水組及假手術(shù)3.1組（P＜0.05），表明轉(zhuǎn)染成功；胸主動脈損傷各組CYP2J3mRNA均表達(dá)上調(diào)，尤以動脈損傷2J3組CYP2J3mRNA表達(dá)更高于動脈損傷鹽水組及3.1組（P＜0.01），提示CYP2J3基因轉(zhuǎn)染后動脈損傷使CYP2J3mRNA表達(dá)進一步提高（圖2）。

圖2 各組大鼠胸主動脈CYP2J3mRNA表達(dá)水平比較（s，n均＝6）

2.3 各組11，12－EET 含量

三個假手術(shù)組之間11，12－EET水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明基因轉(zhuǎn)染對正常胸主動脈11，12－EET水平無顯著影響；胸主損傷各組11，12－EET水平明顯升高（P＜0.01），而動脈損傷2J3組高于動脈損傷鹽水組及3.1組（P＜0.01），說明CYP2J3基因轉(zhuǎn)染可使損傷動脈11，12－EET水平進一步提高（圖3）。

圖3 各組大鼠胸主動脈11，12－EET水平（s，n均＝6）

3 討 論

CYP450單氧化酶可催化AA生成四種EETs：5，6－；8，9－；11，12－；14，15－EETs［1］。作為內(nèi)皮衍生性超極化因子（Endothelium Derived Hyperpolarizing Factor，EDHF）的 EETs具有舒張血管［4］、抗血栓形成［5］、促進血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖［6］等多種血管保護作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，EETs還與血管發(fā)生有關(guān)［7］。研究者還發(fā)現(xiàn)，11，12－EET 作為內(nèi)源性物質(zhì)具有拮抗缺血／再灌注損傷的心臟保護作用及拮抗內(nèi)皮細(xì)胞缺氧／復(fù)氧損傷作用［8］；常氧下 11，12－EET拮抗血管平滑肌細(xì)胞增生及遷移，缺氧下抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和促進其凋亡等多種血管保護作用［9］。

經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)成形術(shù)（PTCA）是目前治療冠心病的最為有效的方法之一，但術(shù)后6個月內(nèi)30～45%的RS嚴(yán)重影響了PTCA的臨床療效［10］。雖然隨后支架置入術(shù)應(yīng)用其中，但支架置入術(shù)后RS發(fā)生率仍為32～35%［11］，使PTCA的遠(yuǎn)期療效受到了很大限制，因此RS的防治成為目前心血管病防治研究的重要課題。有研究認(rèn)為，RS是動脈損傷的愈合過程，有血管彈性回縮、血小板沉積，血栓形成、炎癥反應(yīng)、基質(zhì)沉積、血管重塑、血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）遷移、表型轉(zhuǎn)化、過度增殖和凋亡減少等多種因素參與，其中內(nèi)皮細(xì)胞損傷是RS的始動因素。目前，為防治PTCA術(shù)后RS發(fā)生的措施主要包括藥物治療、介入治療、安放藥物洗脫支架和基因治療。其中基因治療是當(dāng)前研究的熱點，也是防治PTCA術(shù)后RS的一種新方法。

本實驗通過靜脈直接注射裸質(zhì)粒的方法導(dǎo)入CYP2J3重組質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)假手術(shù)2J3組CYP2J3mRNA表達(dá)高于假手術(shù)鹽水組及3.1組，表明轉(zhuǎn)染成功；但假手術(shù)2J3組、假手術(shù)鹽水組及3.1組11，12－EET水平差別無顯著性，提示CYP2J3基因轉(zhuǎn)染未損傷動脈。本研究還發(fā)現(xiàn)，損傷胸主動脈可提高其CYP2J3mRNA表達(dá)，同時提高11，12－EET水平，而動脈損傷2J3組不僅CYP2J3mRNA表達(dá)高于假手術(shù)2J3組及動脈損傷鹽水組，其11，12－EET水平也是如此。提示胸主動脈損傷可能使轉(zhuǎn)染的CYP2J3基因發(fā)揮作用而生成11，12－EET。

對未損傷動脈大鼠進行CYP2J3基因轉(zhuǎn)染及注射pcDNA3.1質(zhì)粒未引起動脈的RLA明顯變化，但胸主動脈損傷則使RLA減小。CYP2J3基因轉(zhuǎn)染胸主動脈損傷大鼠的RLA明顯大于動脈損傷鹽水組及3.1組，表明CYP2J3／EETs系統(tǒng)上調(diào)緩解了動脈損傷后狹窄，提示CYP2J3／EETs系統(tǒng)上調(diào)可能是動脈損傷后防止血管狹窄的重要機制。

動脈損傷后，再狹窄的形成是一個多因素、多環(huán)節(jié)共同作用的復(fù)雜問題，無論是發(fā)病機制和防治措施仍然存在許多疑點和難點，有待于更深層次的研究。

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