高 燕，葉迎春，袁 青，周云剛，黃 黎，劉佳佳△

（瀘州醫(yī)學院：1.免疫學教研室；2.病原生物與免疫學實驗室，四川瀘州646000）

多形核中性細胞（polymorphonuclear neutrophil，PMN，簡稱中性核細胞）來源于骨髓，屬終末分化細胞，正常生命期限約為24～48 h，這就意味著PMN一旦分化成熟即啟動其自發(fā)性凋亡[1]?，F(xiàn)在已知有多種基因參與PMN自發(fā)性凋亡的調控，其中Bcl－2家族成員在細胞凋亡的基因調控過程中起著至關重要的作用[2]。Bax是Bcl－2家族中促凋亡的重要成員之一。Toll樣受體（toll－like receptor，TLR）是一類識別病原相關分子模式（pathogen－associated molecular patterns，PAMPs）的模式識別受體，目前TLRs家族成員中人類有11種，鼠類13種[3]。TLR作為病原體的關鍵效應器，表達于PMN的表面或內部，在機體感染病原體后或與其相應的TLR激動劑結合后，均可導致PMN的活化，從而影響PMN自發(fā)性凋亡的發(fā)生速率，調控機體炎癥反應的發(fā)生與發(fā)展進程。巨噬細胞活化脂肽（macrophage activating lipopeptide－2，MALP－2）是TLR2／TLR6的配體，對PMN功能具有直接效應，是作用于PMN的重要微生物結構識別體[4]。本研究運用TLR激動劑——MALP－2（TLR2／6的配體）刺激人PMN，觀察它們對PMN凋亡和Bax蛋白表達水平的影響，探索TLR激動劑調節(jié)PMN凋亡過程中與相關的Bax蛋白表達水平關系。

1 材料與方法

1.1 材料 RPMI－1640培養(yǎng)液和胎牛血清購自Gibco公司，MALP－2細菌鞭毛蛋白（flagellin）購自Alexis公司，兔抗人Bax多抗（一抗）購自Thermo，羊抗兔IgG－HRP（二抗）購自Santa Cruz公司，內參3磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔多抗購自KPL公司，流式凋亡檢測試劑盒購自Beckman公司。

1.2 方法

1.2.1 PMN的分離 抽取健康志愿者外周靜脈血，經(jīng)Ficoll密度梯度離心法分離后取PMN層，通過臺盼藍拒染實驗及Wright－Giemsa染色法確保細胞活力和純度均達96%以上方可使用。

1.2.2 細胞的培養(yǎng) 調整細胞濃度為2×106個／mL，分別將加入MALP－2 10 ng／mL作為實驗組，加 入flagellin 100 ng／mL作為陽性對照組，未經(jīng)處理的PMN作為陰性對照組，各組均設3個復孔。置37℃、濕度90%、5%CO2的孵箱中培養(yǎng)，按實驗需要收獲不同時間段細胞加以分析。

1.2.3 細胞凋亡率的檢測 分別收獲上述各組培養(yǎng)8 h PMN，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌；4℃，3%甲醛冰上固定30 min；PBS洗滌棄上清液，轉入流式收集管中；加FITC－Annexin V 5μL和PI 2.5μL，混勻后避光冰浴10 min；加Binding buffer 500μL／管；流式細胞儀測細胞凋亡率，Cell Quest軟件分析。

1.2.4 Western blotting分析 分別收獲上述各組培養(yǎng)8 h的PMN，并提取其總蛋白。15μL總蛋白上樣于12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS－PAGE）分離，電轉移至二氟化樹脂（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，5%BSA封閉液室溫封閉1 h。一抗（1∶1 000），4℃孵育過夜，二抗（1∶1 000）育膜60 min；1∶5 000辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的GAPDH多克隆抗體（內參膜）育膜1 h。加入化學發(fā)光底物反應液5 min；于熒光化學發(fā)光圖像分析儀中進行曝光，采用Quantity－one分析系統(tǒng)檢測蛋白條帶的平均密度值。

1.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，組間比較采用one－way ANOVA，檢驗水準為α＝0.05。

2 結 果

2.1 新鮮分離PMN活性純度鑒定 直接倒置光學顯微鏡下觀察，細胞透明，有立體感和折光感，活性好（圖1）；Wright－Giemsa染色后可見細胞絕大多數(shù)為3～4葉核的PMN，純度高（圖2）。

圖1 PMN（光鏡×400）

圖2 PMN（Wright－Giemsa染色×1 000）

圖3 流式細胞儀檢測PMN凋亡率

2.2 流式細胞術檢測PMN凋亡率 陰性對照組PMN自發(fā)性凋亡的發(fā)生率為22.61±3.31（圖3A）；陽性對照組PMN凋亡的發(fā)生率為53.78±7.00（圖3B）；實驗組MALP－2凋亡的發(fā)生率為17.23±3.39（圖3C）。3組凋亡率統(tǒng)計分析見表1。

2.3 Western blotting檢測PMN Bax蛋白的表達 Western blotting檢測PMN Bax蛋白的表達見圖4。

圖4 PMN Bax蛋白的表達（Western blotting）

3 討 論

PMN除了自發(fā)性凋亡外，還存在多種外界因素（如激素、脂多糖、TNF－α）的作用下，發(fā)生凋亡的加速或延遲[5]。Fukata等[6]研究發(fā)現(xiàn)，PMN的激活、活化和趨化整個過程可受TLRs的調控。TLR信號可激活固有免疫、刺激抗原特異性免疫反應，并引發(fā)炎癥反應；促進細胞膜表面表達相關免疫分子；促進免疫細胞的成熟和功能化；抗病毒感染；誘導氧化亞氮依賴性殺菌活性；介導全身免疫病理損傷及其家族間的協(xié)同作用影響免疫應答等。在人體內發(fā)現(xiàn)的TLR家族11個成員中，TLRl、TLR2、TLR4、TLR5和TLR6表達在細胞表面，專門識別細菌產(chǎn)物[7]。flagellin是TLR5的惟一配體，可特異識別結合TLR，介導全身炎癥反應、氧化應激和器官損害[8－9]。而在所有TLRs中，TLR2識別的配體可能最多，包括肽聚糖、脂蛋白、支原體、HSP等，但在識別過程中需與TLR1或TLR6形成二聚體發(fā)揮作用。MALP－2是TLR2／TLR6的配體，在接觸MALP－2后，PMN獲得激活細胞狀態(tài)，分泌IL－8和MIP－1β，吞噬能力增強，細胞表面CD62L表達下調。但MALP－2對休眠PMN的凋亡效應施加的只是一個短期影響，長期持久的效應發(fā)生在MALP－2跨膜轉移后。用MALP－2處理后的PMN移動增強，也是由于動力效應而不是趨化作用。本研究應用流式細胞術檢測了PMN凋亡率情況，結果顯示實驗組細胞凋亡率為17.23±3.39，與陰性對照組和陽性對照組比較細胞凋亡率明顯下降，并且3組之間差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明MALP－2能明顯延遲PMN凋亡的發(fā)生，延長PMN的生命期限。

Bax蛋白是1993年Oltvai等[10]從表達Bcl－2的人B細胞系RLT中鑒定分離出一種新型的蛋白質分子，它是Bcl－2家族中第一個被確認有細胞凋亡促進作用的成員。Bax蛋白可在線粒體膜上形成新的通道、改變原有的通道或者改變線粒體膜的脂質成分或分布，影響線粒體膜的通透性及線粒體膜對其他影響因子的反應性，進而引發(fā)細胞凋亡[11]。在PMN抗／促凋亡基因的平衡調節(jié)中，Bax和Bcl－2兩種基因相互制約，形成細胞凋亡的正負調控。然而，Bcl－2蛋白質家族促凋亡和抗凋亡成員調控細胞凋亡作用的具體機制到目前還不清楚，它可能是一個非常復雜的相互作用的體系。隨著對Bcl－2家族研究的深入，更多的與細胞凋亡相關的基因將會被發(fā)現(xiàn)，人們可以進一步地認識細胞編程死亡的本質及其調控機制。因此，對Bax及Bcl－2家族成員的深入了解有著非常重要的意義。本研究將MALP－2作用于PMN后，從蛋白水平運用Western blotting技術檢測PMN Bax蛋白的表達是否影響。Western blotting檢測結果顯示，實驗組和陰性對照組比較，MALP－2對PMN Bax蛋白的表達水平有下調作用，而且實驗組和陽性對照組比較，Bax蛋白的表達差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），說明不同的TLR激動劑對Bax蛋白的表達可能表現(xiàn)出抑制作用或促進作用，這可能和TLR激動劑類型有關。因此，本研究的實驗結果提示，在TLR激動劑誘發(fā)的PMN生胞凋亡或修復與再生的具體作用機制，將為腦創(chuàng)傷提供新的治療靶點和手段。

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