章旭日 雷明星 連小華*

（1 長(zhǎng)沙市賀龍?bào)w育運(yùn)動(dòng)學(xué)校，湖南 長(zhǎng)沙 400100；2 第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部細(xì)胞生物學(xué)教研室，重慶 400038）

程序性細(xì)胞死亡（programmed cell death，PCD）也稱(chēng)細(xì)胞凋亡，在生物體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、器官的生長(zhǎng)發(fā)育、防御外在及內(nèi)在傷害以及防止癌細(xì)胞的擴(kuò)散等方面均起著非常重要的作用[1]。

毛囊作為表皮的附屬器官，在出生后顯示出周期性的活動(dòng)特性[2]，包括生長(zhǎng)期，退化期和靜止期[3]。凋亡在維持毛囊的周期性活動(dòng)中發(fā)揮著重要的作用，在退化期初期，一系列的凋亡信號(hào)通路被激活，有關(guān)促進(jìn)與抑制凋亡基因之間的平衡調(diào)控被打破，一些內(nèi)源性或外源性的凋亡因子開(kāi)始誘導(dǎo)凋亡信號(hào)通路激活，毛囊的凋亡迅速發(fā)生[4,5]。

在毛囊凋亡的各種信號(hào)通路中，caspase家族的各類(lèi)分子相互級(jí)聯(lián)，在凋亡的發(fā)生中起著重要的作用。而Caspase-3處于凋亡有序級(jí)聯(lián)反應(yīng)的下游，是依賴(lài)Caspase凋亡機(jī)制中起執(zhí)行者核心作用的關(guān)鍵分子，是細(xì)胞凋亡發(fā)生的關(guān)鍵步驟及一切凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的共同通路[6,7]，它的活化是凋亡進(jìn)入不可逆階段標(biāo)志。Caspase-3發(fā)揮活性需要通過(guò)剪切pro-Caspase-3形成活性形式的Active Caspase-3。Active Caspase-3的形成是判斷細(xì)胞凋亡是否執(zhí)行的關(guān)鍵。

Caspase-3及其激活體廣泛的表達(dá)在毛囊的各類(lèi)細(xì)胞中，但目前對(duì)于系統(tǒng)的研究毛囊一個(gè)周期的Caspase-3及其激活體Active Caspase-3的表達(dá)情況知之甚少。由于Caspase-3對(duì)于毛囊周期性維持的重要特性，我們通過(guò)免疫組織化學(xué)系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn)，Caspase-3及其激活體表達(dá)于毛囊的各個(gè)時(shí)期，表現(xiàn)為生長(zhǎng)期較弱，而退化期很強(qiáng)，靜止期較弱。而在毛囊一個(gè)周期中，Active Caspase-3在毛囊的各個(gè)時(shí)相點(diǎn)的表達(dá)量均低于Caspase-3的表達(dá)。我們的研究證明，Caspase-3及其激活體在毛囊中的表達(dá)具有高度的時(shí)空特異性，而毛囊的凋亡活動(dòng)與Caspase-3及其激活體的表達(dá)呈正相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

Caspase-3抗體（santa craze公司），Active Caspase-3抗體（北京博奧森生物科技有限公司），免疫組織化學(xué)試劑盒（北京中衫生物技術(shù)公司），DAB顯色試劑盒（北京中衫生物技術(shù)公司）。石蠟切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

取出生后11d，16d，18d，24d的C57BL/6小鼠各5只，體質(zhì)量分別為130～150、150～170、170～200、200～250g。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 取材

取各鼠齡小鼠背皮4%多聚甲醛固定過(guò)夜，常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋。

1.3.2 免疫組織化學(xué)

5um石蠟切片二甲苯透明，梯度酒精水合，3%H2O2室溫封閉15min，去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。檸檬酸微波抗原修復(fù)。滴加一抗，4℃孵育過(guò)夜。PBS洗，滴加二抗37℃孵育30 min，PBS洗，DAB顯色。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)Caspase-3在B6小鼠毛囊周期中的表達(dá)

在小鼠出生后的11d（圖1A，A’），Caspase-3主要表達(dá)與毛囊的毛球部和毛球部的上段的內(nèi)外根鞘細(xì)胞中，而在小鼠毛囊處于退化期的16d（圖1B，B’）和18d（圖1C，C’），Caspase-3呈現(xiàn)強(qiáng)烈的核表達(dá)于毛囊的各類(lèi)細(xì)胞中，特別是在內(nèi)外根鞘中的表達(dá)量要明顯高于在生長(zhǎng)期的水平；當(dāng)小鼠毛囊進(jìn)入了靜止期（圖1D，D’），Caspase-3依然表達(dá)于毛干的外圍。而毛囊的毛乳頭細(xì)胞在各個(gè)時(shí)期都很少有Caspase-3的表達(dá)。

2.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)Caspsae-3激活體Active Caspase-3在小鼠毛囊周期中的表達(dá)

在小鼠毛囊各時(shí)期中，激活體呈明顯的核表達(dá)于毛囊的各類(lèi)細(xì)胞中。在B6小鼠出生后的11d，激活體在B6小鼠主要表達(dá)在毛囊的毛母質(zhì)，內(nèi)外根鞘幾乎沒(méi)有表達(dá)；在B6小鼠出生后的16d（圖1B，B’），毛囊剛進(jìn)入退化期，激活體在小鼠毛囊的毛球中表達(dá)強(qiáng)烈，而在內(nèi)外根鞘也有部分細(xì)胞開(kāi)始表達(dá)；在小鼠出生后的18d，毛囊正值退化期，激活體非常明顯的表達(dá)于毛囊的毛母質(zhì)，而在內(nèi)外根鞘的表達(dá)非常強(qiáng)烈，遠(yuǎn)高于生長(zhǎng)期和退化期初期的水平。在靜止期，激活體少量的表達(dá)于毛干的外圍部位，且表達(dá)量處于各時(shí)期中最低水平。同樣，毛囊的毛乳頭細(xì)胞很少有激活體陽(yáng)性表達(dá)。

3 討 論

圖1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)C57BL/6 鼠各個(gè)時(shí)期毛囊中Caspase-3表達(dá)

圖2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)C57BL/6 鼠各個(gè)時(shí)期毛囊中Active Caspase-3表達(dá)

毛囊周期性的維持需要凋亡因子的參與，Caspase-3作為凋亡的關(guān)鍵分子，在毛囊發(fā)生凋亡時(shí)必不可少。研究顯示Caspase-3廣泛的表達(dá)于毛囊的各個(gè)部位中，并在要執(zhí)行凋亡的時(shí)候?qū)崿F(xiàn)激活，形成激活體Active Caspase-3。而以往對(duì)于Caspase-3在毛囊中作用往往是作為一個(gè)凋亡的指標(biāo)而限制在某一個(gè)時(shí)相點(diǎn)，并沒(méi)有進(jìn)行系統(tǒng)的研究。我們對(duì)C57BL/6這種最常規(guī)的小鼠為模型，用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)了Caspase-3及Active Caspase-3在小鼠出生后毛囊生長(zhǎng)期，退化期和靜止期的表達(dá)及激活情況。首先，在表達(dá)部位上，我們的研究與以往的研究并無(wú)不同。在毛囊中，Caspase-3及激活體均呈明顯的核表達(dá)于毛囊各類(lèi)細(xì)胞中。在小鼠出生后毛囊處于生長(zhǎng)期中后期，Caspase-3主要表達(dá)在毛囊的毛母質(zhì)以及毛球部上段的內(nèi)外根鞘細(xì)胞中，而其激活體主要表達(dá)在毛母質(zhì)的細(xì)胞，在內(nèi)外根鞘細(xì)胞中表達(dá)很少，這說(shuō)明了雖然內(nèi)外根鞘細(xì)胞有Caspase-3的表達(dá)，但沒(méi)有被激活，所以其在生長(zhǎng)期中后期并不會(huì)有大量的凋亡發(fā)生。在小鼠出生后16d，毛囊處于退化期的初期，Caspase-3及其激活體在毛母質(zhì)和內(nèi)外根鞘都有表達(dá)，而且要比生長(zhǎng)期高?？傮w來(lái)說(shuō)，Active Caspase-3在毛囊各個(gè)部位的表達(dá)都要低于Caspase-3的表達(dá)，說(shuō)明在退化期初期，毛囊已經(jīng)開(kāi)始發(fā)生凋亡，但是凋亡并不是特別的明顯。而在小鼠出生后的18d，毛囊處于退化期的中后期，Caspase-3及其激活體除了在毛母質(zhì)表達(dá)增強(qiáng)，在內(nèi)外根鞘的表達(dá)明顯要比退化期早期高，這表明Caspase-3在退化期中期大量被激活，從而內(nèi)外根鞘發(fā)生凋亡，也進(jìn)一步證實(shí)了在退化期，毛囊的毛球部萎縮，內(nèi)外根鞘縮短是跟Caspase-3的大量表達(dá)及激活是相關(guān)的。而在靜止期，兩者的表達(dá)都低于生長(zhǎng)期和退化期，但Caspase-3與其激活體的表達(dá)有著很大的區(qū)別，Caspase-3表達(dá)在毛干的外圍，包括干細(xì)胞所在的bulge區(qū)，而其激活體Active Caspase-3在這些部位的表達(dá)并不明顯，說(shuō)明Caspase-3并沒(méi)有被激活。毛囊的靜止期是一個(gè)相對(duì)靜止的時(shí)期，其增殖和凋亡活動(dòng)均不明顯，通過(guò)Caspase-3及其激活體的表達(dá)分析正好證實(shí)了這一現(xiàn)象。

而在整個(gè)毛囊的周期中，Caspase-3及其激活體很少或者并沒(méi)有在毛乳頭細(xì)胞中表達(dá)，這表明毛乳頭細(xì)胞在形成之后，其凋亡的進(jìn)程并不會(huì)隨著毛囊的周期而進(jìn)行。所以，到了靜止期，毛囊的細(xì)胞幾乎已經(jīng)凋亡完全，毛乳頭的細(xì)胞還能夠保留。與毛囊的其他結(jié)構(gòu)不同，毛乳頭細(xì)胞是真皮來(lái)源的細(xì)胞，有研究表明，毛乳頭細(xì)胞是毛囊的信號(hào)源，所以，毛囊凋亡的信號(hào)源也很有可能是來(lái)自毛乳頭細(xì)胞，而其自身的凋亡規(guī)律與毛囊的上皮型細(xì)胞并不相同，我們通過(guò)Caspase-3及其激活體在毛囊中的表達(dá)來(lái)看，也正好符合這個(gè)觀點(diǎn)。

因此，認(rèn)為Caspase-3的表達(dá)具有高度的時(shí)空特異性，其表達(dá)與激活誘導(dǎo)毛囊細(xì)胞的凋亡，調(diào)節(jié)毛囊的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和周期性活動(dòng)。但是，毛乳頭的凋亡并不與毛囊的上皮型細(xì)胞的凋亡規(guī)律相同，毛乳頭如何調(diào)節(jié)上皮型細(xì)胞的凋亡，及其自身的凋亡規(guī)律有待進(jìn)一步深入的研究。

本研究從毛囊的一個(gè)周期中從生長(zhǎng)期到靜止期四個(gè)時(shí)相點(diǎn)Caspase-3表達(dá)及其激活體的表達(dá)變化規(guī)律，系統(tǒng)闡明了Caspase-3及其激活對(duì)于毛囊維持其內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)以及周期特性的重要性，為研究毛囊凋亡及周期性活動(dòng)提供了良好的基礎(chǔ)。

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